糖化酶的固定化.docx

糖化酶的固定化及其在葡萄糖生产中的应用工艺

姓名：吴启华 12生物工程1班 学号：1214200027
指导老师：柯德森、姚焱；同组者：严少杰，李海毅；时间:2015/11/30---2015/12/14

摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与糖化酶的浓度的关系。本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化的效果较好；加入20g离子交换剂固定化酶的活力回收为79.1%，偶联率为90.46%，相对活力为82.58%，加入25g离子交换剂固定化酶的活力回收为85.2%，偶联率为92.76%，相对活力为92.54%。重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。

关键词：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力

1、前言：
糖化酶也称葡萄糖淀粉酶（glucoamylase, EC.3.2.1.3）(淀粉-α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能够催化淀粉液化产物---糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖。糖化酶对底物的作用是由非还原端开始，将α-1，4-键和α-1，6键逐一水解，酶作用时糖苷键在C1-6间断裂，所产生的葡萄糖为b构型，几乎100%转变为葡萄糖。工业生产使用的糖化酶主要来自曲霉、根霉及拟内孢霉，它被广泛应用于酿酒、制糖等行业，是非常重要的酶制剂。
酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法（结晶法、分散法、物理吸附法及离子结合法）；化学结合法（包括共价结合法及交联法）；包埋法（包括微囊法及网络法）。
本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：葡聚糖凝胶、离子交换树脂、纤维素等。本实验以离子交换树脂为载体，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，酶的活性回收率高，可反复连续生产，对稀酶有浓缩作用，载体可再生使用。其缺点是：载体和酶的结合力弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在高离子强度下进行反应时，酶易从载体上脱落。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。

2、材料与方法：
2.1材料：（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6缓冲液)，无水乙醇，盐酸。硫代硫酸钠（0.05M），碘溶液（次碘酸钠，0.1M）。硫酸2M。
（2）酶液、固定化酶及固定化后的残留酶液
2.2实验仪器：恒温水浴锅（可达99℃，5个），酸度计（3个），容量瓶，量筒，烧杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，锥形瓶，试管架，吸耳球，pH试纸，滤纸，离心机，离心管，分光光度计等。
2.3试剂：
（1）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。
（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液
A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

2.4操作步骤：
2.4.1.试剂的配制：
糖化酶液：市售商品化糖化酶,去离子pH7的磷酸缓冲液配制，根据标称的活力单位配制为1万单位/ml的溶液，离心去除不溶性杂质，共配4000ml, 4℃备用。
2mol/L氢氧化钠：8gNaOH-----100ml,共配3000ml，
2mol/LHCL:17ml浓盐酸------100ml，共配3000ml，
2.4.2．固定化酶实验步骤：
载体的预处理：
A：乙醇处理：15克湿离子交换剂---50ml烧杯加入30ml去离子水，搅拌，倒去水。注入2倍体积无水乙醇，乙醇浸泡过夜（12h），然后用去离子水连续冲洗以除去乙醇。
B：碱处理：2倍体积（50ml）的2mol/lNaOH浸泡并充分搅拌，再以去离子水冲至pH6.0-7.0
C：酸处理:用2倍体积的2mol/L HCl溶液处理阴离子交换树脂，然后用去离子水洗至pH6.0。
D：重复B
固定化酶实验：
酶的固定化：100ml糖化酶液倒入贮液槽中，加入预处理的离子交换剂20g和25g，不断轻轻搅拌，开始进行酶的固定化，30min后过滤去未固定的酶液，测量固定化酶及反应后残留酶液活性。
2.4.3．葡萄糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管（可用封口胶代替），编号，按表1加入试剂：
表1 葡萄糖标准曲线制作
试 剂
管 号
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0
葡萄糖含量（mg）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
3,5-二硝基水杨酸（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.4.4． 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。
表2 酶活力测定取样表
操 作 项 目 淀粉酶活力测定 固定化酶活力测量
1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min
淀粉酶原液 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.2g 0.2g 0.2g
（1，4二个空白，原酶空白和固定化酶空白的酶预先煮沸失活）
保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min
取反应液0.1ml,加入1.9ml水，迅速加入以下DNS
3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0
将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线（煮沸，定容）。
根据以上反应吸光值的大小调整显色时加入的反应液的量，再加DNS显色，目的是使其达到合理的吸光值，以后者为准计算酶的活力。
2.5酶液浓度对固定化效率及固定化酶质量的研究方法
制备固定化糖化酶, 100ml糖化酶中分别加入预处理的离子交换剂20g和25g，不断轻轻搅拌，开始进行酶的固定化，30min后过滤去未固定的酶液，测量固定化酶及反应后残留酶液活性。

2.6固定化糖化酶生产葡萄糖工艺研究方法
（1）制备固定化糖化酶。
（2）取20ml淀粉溶液，迅速倒入贮液槽中，控制其流出速度为1ml/min，用烧杯接流出的葡萄糖液。测其葡萄糖含量。
（3）重复步骤（2）。

2.7结果计算
在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量（mg），按下列公式计算酶的活力。
酶活力单位（U）＝1 mg葡萄糖产生量/min
酶活力单位的定义：在55C，pH4.6的条件下，在上述反应体系中水解可溶性淀粉产生1mmol葡萄糖，即为一个酶活力单位。对固定化酶以mmol/(min.mg)表示（或U/( mg)）；对液相酶以U/ml或mmol/(min.ml)表示。
活力回收=固定化酶总活力/加入酶总活力*100%
偶联率=载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%
相对活力=固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%
计算第二次重复使用固定化酶的生产效率为第一次使用的百分比

3、结果与讨论：
3.1葡萄糖标准曲线
表3 葡萄糖标准曲线制作（葡萄糖含量/mg）
试管号
1
2
3
4
5
6
7
A540
0
0.034
00.58
0.141
0.250
0.370
0.465

图1 葡萄糖标准曲线

3.2酶活力测定
下表中试管2为稀释10倍的淀粉酶原液取0.1mL测量所得的分光值，试管3为稀释5倍淀粉酶原液取0.1mL测量所得的分光值。
表4 淀粉酶催化淀粉产生葡萄糖分光值
试管号
空白
25g
20g
A540
0
0.253
0.160

表5固定化酶催化淀粉产生葡萄糖分光值
试管号
空白
25g
20g
A540
0
0．124
0.115

表6残留酶液催化淀粉产生葡萄糖分光值
试管号
空白
25g
20g
A540
0
0．168
0.130

数据处理：
（1）淀粉酶（原酶）：
试管2：葡萄糖的含量：(0.253+0.0011)/0.2344*100=110.4mg
每ml酶液酶活力单位（U）：110.4/5=22.88
原酶液总活力单位（U）：22.88*30=640.4
试管3：葡萄糖的含量：(0.160+0.0011)/0.2344*100=68.2mg
每ml酶液酶活力单位(U)：68.2/5=13.64
原酶液总活力单位（U）：13.64*30=409.2
（2）固定化酶：
试管2：葡萄糖的含量：(0.124+0.0011)/0.2344*100=50.6mg
每mL反应液酶活力单位（U）：50.6/5=10.12
0.2g样品酶活力单位（U）：10.12
11g样品酶活力单位（U）：10.12*11/0.2=556.6
试管3：葡萄糖的含量：(0.115+0.0011)/0.2344*100=66.69mg
每mL反应液酶活力单位（U）：66.69/5=13.34
0.2g样品酶活力单位（U）：13.34
10.2g样品酶活力单位（U）：13.34*10.2/0.2=680.19
（3）残留酶液
试管2：葡萄糖的含量：(0.0131+0.0011)/0.2344*110=6.66mg
每ml酶液酶活力单位（U）：6.66/5=1.33
27mL样品酶活力单位（U）:1.33*27=35.98
试管3：葡萄糖的含量：(0.0152+0.0011)/0.2344*110=7.65mg
每ml酶液酶活力单位(U)：7.65/5=1.53
27mL样品酶活力单位（U）:1.53*27=41.31
活力回收: 试管2：固定化酶总活力/加入酶总活力*100%=556.6/686.4*100%=85.2%
试管3：固定化酶总活力/加入酶总活力*100%=680.2/745.8*100%=79.1%
相对活力：试管2：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%=556.6/（686.4-35.98）*100%=92.54%%
试管3：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%=680.2/（745.8-41.31）*100%=82.5%
偶联率：试管2：（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%=（686.4-35.98）/686.4*100%=92.76%
试管3：（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%=（745.8-41.31）/745.8*100%=90.46%

分析以上所得结果可知：分析以上所得结果可知：加入25g交换剂固定化酶的活力回收为85.2%，偶联率为92.76%，相对活力为92.54%，加入20g交换剂固定化酶的活力回收为79.1%，偶联率为90.46%，相对活力为82.5%。

3.3葡萄糖生产效率
表9 25g离子交换剂固定化酶重复生产葡萄糖效率分光值

空白
1
2
A540
0
0.158
0.132
数据处理：
1：样品葡萄糖含量：(0.158+0.0011)/0.2344*200=20.42mg
总葡萄糖含量：20.42*20=428.33mg
葡萄糖生产效率：428.33/20=20.42mg/min
2：样品葡萄糖含量：(0.132+0.0011)/0.2344*200=15.17mg
总葡萄糖含量：15.17*20=321.55mg
葡萄糖生产效率：321.55/20=15.17mg/min

表10 20g离子交换剂固定化酶重复生产葡萄糖效率分光值

空白
1
2
A540
0
0.130
0.115
数据处理：
1：样品葡萄糖含量：(0.130+0.0011)/0.2344*200=14.17mg
总葡萄糖含量：14.17*20=223.55mg
葡萄糖生产效率：223.55/20=14.17mg/min
2：样品葡萄糖含量：(0.115+0.0011)/0.2344*200=11.47mg
总葡萄糖含量：11.47*20=229.4mg
葡萄糖生产效率：229.4/20=11.47mg/min
表11 保温后固定化酶重复生产葡萄糖效率分光值

空白
25g
20g
A540
0
0.198
0.145
未保温前A540分别是0.158和0.130,说明固定化酶有脱落。

结论：无论加入20g交换剂和25g交换剂，即酶与载体的浓度比例不同,都是第二次使用固定化酶的葡萄糖生产效率比第一次低，证明这两批固定化酶在重复使用的过程中，固定化酶的利用效率降低较快，固定化酶重复使用的能力较弱，对葡萄糖生产效率影响较大。这有可能是固定化酶在使用过程中脱落和固定化酶活力下降引起的，从保温等实验可以看出，两种条件制备的固定化酶在使用过程中都有一定的脱落，从实验看出酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。

4、参考文献：
[1] 柯德森.生物工程下游技术实验手册.北京:科学出版社.2010.
[2] 陈雄.  固定化糖化酶的研究[J]. 中国酿造. 2001(02)
[3] 孙俊良,赵瑞香,李国龙,汪金萍.  糖化酶固定化技术在糯米酒生产中的应用 [J]. 食品与发酵工业. 2004(04)
[4] 周剑平,魏甲乾,龚伟中,王治业,杨晖.  固定化糖化酶性质及其应用的研究 [J]. 甘肃工业大学学报. 2003(04)
[5] 王家东,姜子明,曹彬,毕韬韬,侯红萍.  固定化糖化酶的研究[J]. 中国调味品. 2006(03)

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