培养基的灭菌.doc

玻璃器皿的洗涤和包装

玻璃器皿的洗涤和包装
1. 玻璃器皿的洗刷：玻璃器皿的使用前必须洗刷干净。锥形瓶、试管、 培养皿等浸入水中洗涤，用毛刷和洗衣粉洗刷，然后再用水冲净。移液管 先用洗液浸泡，再用水冲洗。洗刷干净的玻璃仪器在电热干燥箱中烘干后 备用。 2. 玻璃器皿灭菌前的准备工作： （1）培养皿又称双碟或平皿，由一底一盖组成一套。可以每套单独使用 纸包装，也可将几套一起用纸包装； （2）移液管应在距管口约1-2毫米处用铁丝塞入少许棉花（约1-1.5厘米 长）；以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞的松 紧适宜。炊时以能通气但不使棉花滑下为准。塞好棉花的移液管尖端，放 在4-5厘米宽的长条纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手 握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌上向前搓转，以螺旋式包扎起来。 上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。

3. 棉塞的制作
为了过滤空气，避免污染，试管或锥形瓶口需用棉花堵塞（脱脂棉易吸 水，勿用）。为了节省棉花或节省时间，在配置实验临时所用的无菌水 和培养基时，也可以用金属试管帽代替棉塞。装液体培养基的锥形瓶口， 可包扎6-8层纱布以代替棉花。 制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指 和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞， 然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷 塞法制作棉塞（见图2-2）。
制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙， 以防外界微生物沿缝隙浸入。棉塞 不宜过紧或过松，塞好后以手提棉 塞，以瓶、管不下落为准。

图2-2 棉塞的制作过程

实验 培养基的制备与灭菌

棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。如制作 时不慎沾上培养基，则不可再用。在棉塞和平口外要包 以厚纸，或将塞好后的试管集中放在铁丝筐内，上面盖 以厚纸，用线绳扎好，准备灭菌，避免灭菌后冷水淋湿 棉塞，并防止接种前培养基水分散失。 上面配制好的各种培养基，分装于锥形瓶内和试管中， 分别加以捆扎，做好标记。然后灭菌备用。

一、实验目的
1. 了解培养基的配制原理，掌握常用培养基 的制备方法； 2. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。

二、基本原理 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累 代谢产物的营养基质。任何培养基中均需含有微生 物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生 长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营 养元素的要求又有很大差异。不同微生物对PH值要 求不一样，应将培养基调到一定的PH值范围。

根据研究目的的不同，可将培养基制成固 体、半固体和液体三种形式。 固体培养基是在液体培养基中加入1.52.0%的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加 入0.5-0.8%的琼脂。有时为了特殊的目的， 也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。

由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培 养基。在分离、培养异养微生物时，对一般细菌 常选用牛肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏 合成I号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或 豆芽汁葡萄糖培养基。

三、实验器材

1. 药品：牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；琼脂； 2. 仪器及其他：试管；移液管；锥形瓶；烧杯； 量筒；玻璃棒；漏斗；纱布；棉花；报纸；天平或 台秤；等。

四、实验内容 （一）常用培养基的配制
1. 肉膏蛋白胨培养基（用于分离及培养细菌）成分： 牛肉膏 0.5g； 蛋白胨 1.0g； 氯化钠 0.5g； 琼脂 1.5－2.0g； 水 100mL； PH 7.0－7.2

1、配制培养基的基本过程如下： （1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于烧杯中； （2）溶解：在上述烧杯中加入所需水量（根据实验需要可加 入蒸馏水或自来水）搅匀，加热溶解。应在药品全部溶解后 加水补足加热过程所蒸发的水分。配制固体培养基时，应将 已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热 至琼脂完全融化，并不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补 足失去的水分； （3）调PH值：用1N NaOH或1N HCl调PH至7.2，尽量避免回 调； （4）分装、包扎灭菌

注意： （1）牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后
倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中， 牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮， 故称量时要迅速

（2）配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基煮沸，
再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全融化，并不断 搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分；或者将 琼脂单独溶解再加入到已配好的培养基中

（3）调pH 检测培养基的pH，边加边搅拌，并随 时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。pH的 调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过 头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度

2. 斜面培养基制作法 将已灭菌的装有琼脂培养基的试管，趁热置使成适当斜度， 凝固后即成斜面（图2-3）。制得的斜面以稍有凝结水析 出者为佳。如果制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后 则应垂直放置至冷凝。 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出12管（瓶），放在30-37℃恒温箱中保温1-3天，不长菌者 即证明灭菌已彻底，再放阴暗处保存。

图2-3 摆斜面

3、倒平板
（1）超净台紫外灭菌，溶化培养基 （2）酒精清洁手 （3）标记 （4）打开三角瓶 （5）左手拇指和食指打开培养皿上盖，右手托三角 瓶瓶底，倒入约15mL左右（少于1/2）培养基，水 平放置，使培养基平铺 （6）待培养基凝固后，收起，常温培养检测无菌操 作结果

五、实验报告
1. 分析你所配制培养基中的碳源、氮源、 能源、无机盐及维生素的来源。 2.如何检查灭过菌的培养基是无菌的？

培养基的配制和灭菌
发布日期：2008-07-17 来源：生技网信息中心 浏览次数：808
以1000 ml “MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）琼脂 + 3%（即30 g/l）蔗糖”为例。第一步：准备好配制培养基的一切用具和试
以1000 ml “MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）琼脂 + 3%（即30 g/l）蔗糖”为例。
第一步：准备好配制培养基的一切用具和试剂。
第二步：称量5 g琼脂和30 g蔗糖，溶解在大约所要配制培养基 2/3~3/4左右体积（约600~750 ml）的（蒸馏）水中，加热溶解，不时搅拌，避免出现琼脂生块和泡沫。
第三步：根据用量，用量简或移液管从母液中取出所需量的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素（每做1000 ml培养基，取20 ml大量成分、20 ml氯化钙母液、10 ml微量成分、10 ml铁盐母液和10 ml有机成分，以及3.0 mg NAA），放入预先有少量蒸馏水的烧杯中（以免加药液时溅出），然后加入琼脂和糖水溶液中搅拌混匀。
第四步：加水定容。待搅拌均匀后，用数滴稀碱（NaOH）将pH值调节到预定水平（一般为pH 5.8），当pH值偏碱时用稀酸（HCl）调节。用pH试纸或酸碱指示（或pH）计测定培养基的pH值。
第五步：将培养基用漏斗分装到培养容器中。每瓶加15~20 ml左右，之后加盖。
第六步：培养基进行灭菌。高压蒸气灭菌锅的温度为121℃，灭菌15~20分钟。
培养基常用高温高压（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121℃）蒸气灭菌的方法，灭菌时间应根据培养瓶体积大小及其内培养基容量多少而定（见表4）。体积和容量越大，所需灭菌时间就越长。空试管、空三角瓶和滤纸要在130℃下灭30分钟或121℃灭60分钟。空的培养容器不应同盛装培养基的培养容器一起高压蒸气灭菌，不同体积培养容器或盛装不同容量的培养基也不能一起高压蒸气灭菌，而应该分别进行。因为热穿透力是一个需要考虑的因素，体积大的培养容器需要较长的时间灭菌，是因为热量穿透大体积培养基要比体积小的花更多的时间。利用高压蒸气灭菌锅进行灭菌具有简单、快速，并且可以附带杀灭病毒又不吸收的优点（与过滤灭茵比较）。其缺点是会引起pH值的变化、发生化学变化和引起某些化合物的分解，使得某些培养基成分的活性丧失。高压蒸气灭菌会引起以下物质分解：蔗糖（分解为葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%会丧失反应活性）维生素B1、B12、C和泛酸、抗生素、酶、植物提取液（活性丧失）。所以，原生质体培养用培养基应采用过滤法灭菌。
表4 培养基或无菌水的最少灭菌时间
容器分装体积（mL） 121℃下最少灭菌时间（min）
20~60 15
75~150 20
250~500 25
1000以上 30以上
过滤灭菌可以除去溶液或液体培养基中直径大于过滤膜网孔直径的微粒、微生物和病毒。与高压蒸气灭菌法相比，该法不会改变那些在高压蒸气灭菌中不稳定物质，但是也有些明显的缺点，如复杂而费时。通常采用0.22~0.45μm孔径的醋酸纤维素或硝酸纤维素膜筛。对培养基中的不稳定成分进行过滤灭菌时，首先对除不稳定成分以外的培养基进行高温高压灭菌，灭菌后放置于超净工作台中冷却，温度降到 40~50℃时，在琼脂培养基尚未固化之前，在无菌条件下用注射器和无菌微孔滤膜（图1.7）将高温不稳定物质溶液打入培养基。

一一一一、 、、、培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术 培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的用于培养微生物的营养基质。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。就培养基中营养物质的来源可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。按培养基特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。按培养基制成后的物理状态可分为固体培养基，液体培养基和半固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %-2.0 %琼脂作凝固剂; 半固体培养基则加入0.5 %-0.8 %的琼脂。 一般培养基除含有大量水分外, 还含有碳素、氮素、无机盐类和维生素等。此外, 由于徽生物生长繁殖必须在最适的酸碱度范围内, 才能表现出最大的生命活力, 因此应根据不同种类的徽生物. 将培养基调节到一定的pH值范围。 培养基配制后还必须进行灭菌, 灭菌是指杀死或消灭所有微生物, 包括营养体、孢子和芽孢。灭菌的方法很多，可分为物理方法与化学方法两大类。物理方法包括湿热灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等; 化学方法主要是利用化学药品对接种室空间、用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。消毒一般是指消灭有害微生物的营养体和病原菌。 ((((一一一一) ) ) ) 培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法 一般培养基的配制方法如下 (各种天然培养基的配制方法略有不同)： l. 按照配方的组分及用量先分别称量并配成液体； 2. 根据要求调到一定的酸碱度(pH值)； 3. 若要制成固体则加入2%琼脂并加热融化； 4. 根据需要的数量分装入试管或三角瓶中, 加上棉塞或盖上纱布； 5. 包扎好灭菌后备用。 配制斜面培养基的一般操作步骤为：称量 → 溶解 → 调pH值 → 加琼脂 → 过滤 → 分装 → 加棉塞 → 包扎 → 灭菌 → 摆斜面 → 无菌检查。 (图9-7) ((((二二二二) ) ) ) 培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌 培养微生物常用的玻璃器具主要有试管、三角瓶、培养皿、吸管等, 在使用前必须先进行灭菌, 使容器中不含任何杂菌；培养微生物用的营养基质(培养基), 在接入纯种前也必须先行灭菌, 使培养基呈无菌状态。培养基可分装入器皿中一起灭菌, 也可在单独灭菌后以无菌操作分装入无菌的器皿中。 1. 棉塞制作与器皿包扎为了避免玻璃器皿在灭菌后再受空气中杂菌的污染, 仍然能保持无菌状态, 在灭菌前需进行严格的包装或包扎。试管和三角瓶常采用合适的棉花塞封口 (也可采用金属、塑料及硅胶帽套), 棉塞起过滤作用，只能让空气透过, 而空气中的微生物则不能通过。制作棉塞应采用普通未脱脂的棉花（医用脱脂棉会吸水，不宜采用）, 其制作方法有几种，可自行灵活掌握。制好的棉塞要求紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙； 总长度约为管口直径的2倍， 插入部分约为2/3, 松紧度合适；外露部分的粗细及结实程度，应合乎一定要求。 若因棉花纤维过短，可在棉塞外面包上1层纱布，便于无菌操作，减少棉塞的污染机率，并可延长棉塞使用时间。新做的棉塞弹性较大，不易定形, 但插在容器上经过一次高压蒸汽灭菌后，形状大小即可固定。三角瓶也可用8～12层纱布代替棉塞, 通气效果更佳。 蒸汽灭菌前, 一般将7-10支试管用绳扎在一起，用牛皮纸包裹棉花塞部分，再用绳扎紧；每个三角瓶可单独用牛皮纸包扎棉花塞部分, 防止水蒸汽弄湿。 培养皿是专为防止空气中杂菌的污染而设计的, 底皿加上皿盖为一套。洗净烘干后通常每10套叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，外面用绳子捆扎以防散开，然后进行灭菌。到使用时，才在超净工作台中取出打开。 洗净烘干的吸管，在吸气的一端用镊子或针塞入少许未脱脂棉花(棉花勿外露)，以防止菌体误吸入洗耳球中，或洗耳球中的微生物通过吸管而进入培养物中造成污染。每支吸管用一条宽约5 cm的纸条，以约45度角螺旋形卷起来，剩余一端折叠打结。灭菌后烘干，使用时才在超净工作台中从纸条抽出。 2. 培养基与器皿的高压蒸汽灭菌 一般培养基、无菌水、耐热药物及玻璃器皿等常采用高压蒸汽灭菌法。该法的优点是时间短, 灭菌效果好。它可以杀灭所有的微生物, 包括最耐热的细菌芽孢及其它休眠体。 一般培养基常用0.1MPa (1 kg/cm2或15 Ib/in2 ), 约120℃维持15-20分钟, 便可达到彻底灭菌的目的；单独玻璃器皿灭菌的温度可高些, 维持的时间可长些。灭菌的温度及维持的时间, 应随灭菌物品的性质和容量多少而灵活掌握。要注意灭菌的因素是高温而不是高压, 故灭菌锅内的冷空气要彻底排除 (在排除冷空气的条件下, 蒸汽压与温度之间有一定关系)，否则, 压力虽达到0.1Mpa (l kg/cm2 ), 但温度并没有达到要求。 实验室常用的有自控或非自控卧式高压蒸汽灭菌锅 (大量灭菌物品时使用), 也有手提式小型灭菌锅 (见图3-12)。 3. 玻璃器皿的干热灭菌 常用玻璃器皿(培养皿、三角烧瓶、试管、吸管等)、金属器皿及其它干燥耐热物品, 烘干后经适当包扎(勿装液体), 可采用干热灭菌法。干热灭菌一般在电烘箱内利用干热空气灭菌。 该法比湿热灭菌法所需的温度要高些 (160-170℃), 时间也要长些 (1-2 h)。但灭菌温度若超过180℃, 包扎器皿的纸或棉塞就容易烧焦。 二二二二、、、、无菌操作技术无菌操作技术无菌操作技术无菌操作技术 微生物无处不在, 无孔不入, 因此, 在对微生物的研究和应用过程中, 必须随时注意保持微生物纯培养物的纯洁性, 防止乃至杀灭其他微生物(杂菌)的混入；在进行分离、转接及培养微生物纯培养物时, 要采用严格的无菌操作技术, 防止被其他微生物所污染。 在微生物学研究中, 常需用接种环把微生物纯培养物, 由一个器皿移接到另一个培养容器中进行培养。由于周围环境(主要是空气)中, 存在着大量肉眼无法发现的各种微生物, 只要一打开器皿，就可能会引起器皿内的培养基或培养物, 被环境中其他微生物所污染。此外，实验室人员与所试验的微生物，应保证没有或最少直接接触或气雾接触。 因此, 微生物菌种移接的所有操作, 均应在无菌环境下进行严格的无菌操作。 ((((一一一一) ) ) ) 无菌环境条件无菌环境条件无菌环境条件无菌环境条件 无菌环境是指在无菌室、无菌箱、超净工作室或超净工作台等无菌或相对无菌的环境条件下进行操作。 超净工作室或超净工作台目前较常用, 它是用通入经超细过滤的无菌空气, 以维持其无菌状态的；而无菌室或无菌箱目前较少用, 它是在使用前一段时间内, 用紫外线灯或化学药剂进行室内空气灭菌, 以维持其相对无菌状态的。 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。紫外线穿透力不强, 所以只适用于无菌室、接种箱和手术室内的空气及物体表面的灭菌。 ((((二二二二) ) ) ) 无菌操作接种技术无菌操作接种技术无菌操作接种技术无菌操作接种技术 上述的无菌环境条件只是相对而言, 实际上不可能保持环境的绝对无菌。因此接种时, 关键是要严格进行正确的无菌操作, 其要点是要充分利用酒精灯焰周围的高温区(无菌区), 即接种时, 管口和瓶口始终保持在火焰 (如酒精灯焰)旁边, 进行熟练的移接种操作, 以便保证微生物的纯种培养。 此外，挑取和移接微生物纯培养物用的接种环及接种针, 应采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备, 使用时用火焰灼烧灭菌；转移液体纯培养物时, 应采用无菌吸管或无菌移液枪。 接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染, 因此, 除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外, 熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。常用的无菌接种操作包括斜面接种、穿刺接种和液体培养接种等。穿刺接种操作

培养基的配制与灭菌
一、目的和要求
通过人工配制供微生物生长繁殖所需的固体培养 基、液体培养基，进一步了解微生物生长所需的 液体培养基， 营养物质，要求同学们熟练掌握好供细菌、 营养物质，要求同学们熟练掌握好供细菌、酵母 菌、霉菌等微生物生长繁殖所需的培养基及微生 物实验中消毒与灭菌的原理与方法。 物实验中消毒与灭菌的原理与方法。

二、实验原理
根据微生物生长繁殖所需要的六大营养物质、 根据微生物生长繁殖所需要的六大营养物质、 微生物生长繁殖所需的环境条件（水分、ｐＨ 微生物生长繁殖所需的环境条件（水分、ｐＨ 渗透压、氧气等）来配制微生物的培养基。 值、渗透压、氧气等）来配制微生物的培养基。 利用高温灭菌的基本原理， 利用高温灭菌的基本原理，采用高压蒸汽灭菌 锅对培养基进行灭菌， 锅对培养基进行灭菌，以保证纯微生物培养体 的形成。 的形成。

三、器具材料
见实验教材。 见实验教材。

四、操作方法
⒈ 实验内容
配制牛肉膏蛋白胨培养基（固体600mL，斜面 支与 ⑴ 配制牛肉膏蛋白胨培养基（固体 ，斜面/30支与 三角瓶/400mL）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（固体 ）、马铃薯蔗糖琼脂培养基 三角瓶 ）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（ 600mL，斜面 支，三角瓶 ，斜面/30支 三角瓶/400mL）孟加拉红培养基 ） 固体，三角瓶/500mL ）、无菌生理盐水（共配 ）、无菌生理盐水 无菌生理盐水（ （固体，三角瓶 2400mL ， 三角瓶 三角瓶500mL / 8个，试管 支 ）—分离酵 个 试管30支 分离酵 母菌用 ⑵ 制作棉塞，包扎吸管与培养皿 制作棉塞， ⑶ 湿热和干热灭菌

⒉ 培养基配制的基本过程
原料称量、 ⑴ 原料称量、溶解 ⑵ 调整酸碱度（pH值） 调整酸碱度（ 值 ⑶ 培养基的过滤和澄清 ⑷ 培养基的分装 ⑸ 塞棉塞和包扎 ⑹ 培养基灭菌

培养基的分装

斜面培养基 的摆法

⒊ 消毒与灭菌 ⑴火焰灭菌
直接用火焰烧灼灭菌，迅速彻底。 直接用火焰烧灼灭菌，迅速彻底。接种环接种针或其它金属 用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。 用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。

⑵干热灭菌
通过使用干燥热空气(170℃)去杀灭微生物的方法称为干热灭 通过使用干燥热空气(170℃)去杀灭微生物的方法称为干热灭 (170℃) 玻璃器具(如吸管及培养皿等) 菌。玻璃器具(如吸管及培养皿等)，金属用具等凡不适于其 它方法灭菌而又能耐高温的物品都可以用此法灭菌， 它方法灭菌而又能耐高温的物品都可以用此法灭菌，而培养 橡胶制品、塑料制品等都不能用于热灭菌。 基、橡胶制品、塑料制品等都不能用于热灭菌。干热灭菌的 方式，一般是把待灭菌的物品包装就绪后， 方式，一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘 烤，即加热到160℃-170℃，维持1-2h。 即加热到160℃-170℃，维持1 2h。 160℃ 玻璃器皿如培养皿、吸管等在灭菌前应洗净、晾干( 玻璃器皿如培养皿、吸管等在灭菌前应洗净、晾干(一定注 意干燥，如有水滴，灭菌时易炸裂)并包装得当。 意干燥，如有水滴，灭菌时易炸裂)并包装得当。

⑶ 常压蒸汽灭菌
属湿热灭菌方法之一。是在不能密闭的容器里， 属湿热灭菌方法之一。是在不能密闭的容器里，将水烧开产生 蒸汽来灭菌。 蒸汽来灭菌。 技术指标：常压，温度不超过100 ℃。时间；30-60min灭菌对 技术指标：常压，温度不超过100 ℃。时间；30-60min灭菌对 牛奶、糖液、明胶等不耐热物质。 象：牛奶、糖液、明胶等不耐热物质。

⑷ 高压蒸汽灭菌
使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时只需采用121.6℃维持30min或 使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时只需采用121.6℃维持30min或 121.6℃维持30min 126.5℃保持 2h(对较大 较厚固体物而言) 保持1 对较大、 126.5℃保持1-2h(对较大、较厚固体物而言)就可达到对物品 进行完全灭菌的要求。究其原因有三： 进行完全灭菌的要求。究其原因有三：一是蛋白质凝固变性与 蛋白质的含水量有关，含水量较高者其凝固所需要的温度低， 蛋白质的含水量有关，含水量较高者其凝固所需要的温度低， 含水量较少者其蛋白质凝固所需温度高， 含水量较少者其蛋白质凝固所需温度高，当微生物菌体处于湿 热中时，其细胞吸收水分，使菌体蛋白质较易凝固常用的培养 热中时，其细胞吸收水分， 水及其他不适于干热灭菌的物品如橡皮管、橡皮手套等， 基，水及其他不适于干热灭菌的物品如橡皮管、橡皮手套等， 均可采用此法灭菌。 均可采用此法灭菌。

⑸ 巴斯德灭菌法
技术指标： 30min或 15min。灭菌对象：牛奶、 技术指标：60 ℃ 30min或70 ℃ 15min。灭菌对象：牛奶、 啤酒、黄酒、酱油、食醋、某些果汁、饮料等。 啤酒、黄酒、酱油、食醋、某些果汁、饮料等。

⑹ 化学药剂消毒灭菌
微生物研究工作中常用的化学药剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、 微生物研究工作中常用的化学药剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、 酒精、碘酒、龙胆石碳酸，煤酚皂溶液、漂自粉， 酒精、碘酒、龙胆石碳酸，煤酚皂溶液、漂自粉，新洁尔灭 它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。 等，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。

⑺

过滤除菌

利用陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成细菌过滤器， 利用陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成细
菌过滤器，采用 抽气减压的方法进行过滤，以达到去除杂菌的目的。 抽气减压的方法进行过滤，以达到去除杂菌的目的。 灭菌对象：抗生素、血清、疫苗、毒素、维生素、空气等。 灭菌对象：抗生素、血清、疫苗、毒素、维生素、空气等。

⑻紫外杀菌
紫外线是日光中的一部分，波长 紫外线是日光中的一部分，波长2600Å-2500 Å 之间的紫 外线具有很强的杀菌能力。易被细胞中的核酸吸收， 外线具有很强的杀菌能力。易被细胞中的核酸吸收，造成 细胞损伤而且有明显杀菌效果。一般紫外灯近距离 细胞损伤而且有明显杀菌效果。一般紫外灯近距离2030cm照射 照射3-5min即可将细菌营养体杀死，十几分钟后芽 即可将细菌营养体杀死， 照射 即可将细菌营养体杀死 孢也会死亡。 孢也会死亡。 灭菌范围：接种室、接种箱、手术室、 灭菌范围：接种室、接种箱、手术室、药厂包装室等空间 的空气灭菌和物体表面灭菌。照射前可喷洒石炭酸、 的空气灭菌和物体表面灭菌。照射前可喷洒石炭酸、煤酚 皂溶液等化学消毒剂以加强灭菌效果。 皂溶液等化学消毒剂以加强灭菌效果。

高压蒸汽灭菌锅构造

安全阀

压力表 放气阀

A

内层 外层 放水处
C

立式高压蒸汽灭菌锅
温度计 安全活塞
B

手提式高压蒸汽灭菌锅

压力表

蒸汽入口
排气口

卧式高压蒸汽灭菌锅

高压蒸汽灭菌锅的使用方法
1. 将内层灭菌桶取出， 加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的 使水面与三角搁架相平为宜。 水，使水面与三角搁架相平为宜。 放回灭菌桶，将待灭菌物品放人桶内。 装锅 放回灭菌桶，将待灭菌物品放人桶内。三角瓶 与试管口端不要与桶壁接触。 与试管口端不要与桶壁接触。 将灭菌锅盖盖上， 加盖 将灭菌锅盖盖上，并将盖上的排气软管插入内 层灭菌的排气槽内。 层灭菌的排气槽内。再以对角线的方式同时旋紧相对称 的两个螺栓 。 接通热源，同时打开排气阀， 加热排气 接通热源，同时打开排气阀，待冷空气完 全排尽，关上排气阕， 全排尽，关上排气阕，让锅内的温度随蒸汽压力增加而 逐渐上升。 逐渐上升。

2.

3.

4.

当锅内压力升至所需压力时，控制热源， 5. 保温保压 当锅内压力升至所需压力时，控制热源，维持压 力(温度)到所需时间。 温度)到所需时间。 灭菌所需时间到后，撤离热源， 温度自然下降， 6. 降温出锅 灭菌所需时间到后，撤离热源，让 温度自然下降， 当压力表的压力降至0 当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松固定螺栓，打 打开排气阀，旋松固定螺栓， 开盖子，取出灭菌物品。 将灭菌物品取出后， 开盖子，取出
灭菌物品。 将灭菌物品取出后，需要摆斜面 的培养基稍冷却后趁热摆成斜面。 的培养基稍冷却后趁热摆成斜面。 灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出， 7. 保养 灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁 及搁架干燥。 及搁架干燥。盖好锅盖 (勿拧螺栓)。 勿拧螺栓)

使用电烘箱干热灭菌时应注意以下问题
1. 灭菌物品在箱内不能推放太满，一般不要超过总容量的2/3， 灭菌物品在箱内不能推放太满，一般不要超过总容量的 ， 灭菌物之闻应留有一定空隙。 灭菌物之闻应留有一定空隙。 2. 灭菌物品不能直接放在烘箱的底板上，即使需要放得很低， 灭菌物品不能直接放在烘箱的底板上，即使需要放得很低， 也要甩铁筐子架起。灭菌物品的包装物，如纸、棉花或纱布 也要甩铁筐子架起。灭菌物品的包装物，如纸、 等，不能接触到烘箱内壁的铁板，因为铁板温度一般高于箱 不能接触到烘箱内壁的铁板， 虑空气温度，容易烘焦着火。 虑空气温度，容易烘焦着火。 3. 升温时或灭菌物品有水分需要迅速蒸发时，可打开进气孔 升温时或灭菌物品有水分需要迅速蒸发时， 和排气孔，待达到所需温度 如 和排气孔，待达到所需温度(如165℃)后，将进气孔和排气 ℃后 孔关闭，使箱内温度一致。 孔关闭，使箱内温度一致。

4. 灭菌温度以控制在 灭菌温度以控制在160℃-170℃保持 为宜。 ℃ ℃保持1-2h为宜。超过 为宜 170℃，包装纸就将变黄，超过180℃，纸或棉花等就会 ℃ 包装纸就将变黄，超过 ℃ 烤焦至燃烧。 烤焦至燃烧。如因不慎或其他原因烘箱内发生纸或棉花烤 焦或燃烧的事故时，应立即先关闭电源，将进气孔、 焦或燃烧的事故时，应立即先关闭电源，将进气孔、排气 孔关闭，令其自行降温到 ℃以下时,才能打开箱门进行 孔关闭，令其自行降温到60℃以下时 才能打开箱门进行 处理，切勿在未断电源前打开箱门或排气孔， 处理，切勿在未断电源前打开箱门或排气孔，以免促进燃 烧造成更大事故。 烧造成更大事故。 5. 正常情况下，灭菌完毕，让其自然降温到 正常情况下，灭菌完毕，让其自然降温到100℃以后，打 ℃以后， 开排气孔促使降温，降到 ℃以下时(视室温而定 视室温而定)再打开 开排气孔促使降温，降到60℃以下时 视室温而定 再打开 箱门取出灭菌物品，以免骤然降温使玻璃器具爆破。 箱门取出灭菌物品，以免骤然降温使玻璃器具爆破。

五、作业与思考题
1．高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低， 高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低， 时间短？ 而 时间短？ 2．为什么高压蒸汽灭菌要求首先必须排尽锅内的空气？灭菌完毕后为什么要待压力降到0时才能 冷空气？灭菌完毕后为什么要待压力降到0 打开排气阀开盖取物？ 打开排气阀开盖取物？ 紫外线灭菌的原理是什么？ 3．紫外线灭菌的原理是什么？ 冷