真菌培养基营养成分原理分析.pdf

彭城大学学报”9 94年第l一2期(第9卷 总第 2 4一2 5期)真菌培养基营养 成分原理分析傅月华李永培养 基(Culturemedia)是适 合于 微生物生长繁殖 的各 种营 养物质配制而成的 营 养基质。根据 微生物的生理需 要,培养基主 要成分包括:水分、碳源、氮源、无机元素和生 长因子等,此外,还应根据 微 生物培养目的 的 要 求,加入 一定 的具有鉴别指示作用或有选择性抑菌作用的物 质。关 于培养 基 营养成分原理的分析 很少有 系统的报道,本 文 根据 营 养 成分的 作用原 理,对 真 菌培 养 基的 营 养成分进 行了分类和分 析。一、基础营养成分分析细菌、霉 菌等多种 微生 物 在培养基 中生长 繁 殖所共同 需要 一 些营 养物主要 功 能:一是 供给 微生物合成体细胞 的原 生质及 其代谢产 物所需的 氮 源和碳源;二 是 供 合成反应及生命活动所需 的能 量;三是 调 节 新陈代谢 作用。常用基础 营养物 质作 用原理 分析如下。1、肉浸液常用 去除脂肪及 筋健 的 新 鲜 瘦牛 肉,充分 绞 碎 后按 重 量加3倍 水 置 冰 箱 内浸 泡一夜,再 经 煮 沸半 小时.过 滤分装灭菌后即得。牛 肉 浸 液 中可溶性营 养物极 为丰 富,约 占 原肉重的2吮,其中含氮物 有:肌 酸、黄嗓吟、次黄嗓 吟、腺嗦吟、核昔酸、尿酸、谷 酞胺、肌肤、肉 毒碱、甘氨酸、日一丙 氨酸等;不 含氮的物 质有:葡 萄糖、肝糖、磷酸已糖、乳酸、虎 拍 酸、肌醇无 机盐类和微 量脂肪;另外.尚有:硫胺、核一80一黄素、泛酸、尼克 酸、生物 素、毗 哆醉、叶 酸和对 氨基苯 甲酸 等8种乙族 维 生 素,可作为微生物 的生长因子.肉浸液也 可用免 肉或动物 胎盘、心、肝等脏器的 浸出 液代替.营养物也 很丰富,但猪肉因脂肪过多则不适用。肉浸液 因含糖分较多,不 适用于糖发酵试 验的 生化鉴别培养基,以免反应异常。2、牛肉 浸膏牛 肉浸 膏是牛 肉的浸 出物及微量水 解物经过 低温浓缩而制 成的半流体膏状物。常用0.3一0.5%的 牛 浸膏 水 溶 液代替牛肉浸液,制成 肉膏汤或 肉膏汤 琼脂等用以培养各种微生物。牛 肉膏因在浓缩过程中,大部分搪类和维生 素已被破坏,故含糖量极少;有些 牛 肉膏中 尚含 有微 量的 牛 肉胰酶 消化物,因而 含少量 氮基 酸.其 他成分和牛肉浸液 的 主要成分大致相近,可用以制成 无糖 肉汤保藏菌种.3、蛋白陈是用动物 或植物性 蛋 白质,经过蛋 白酶适 当的 水解,精 制而成的蛋 白质各种衍生物,如陈、肤及氨基酸等 复杂的混 合物.其 中因陈的 含量较多、故名 为蛋 白陈,是培 养细菌、霉菌等微 生物生 长繁殖 最好的综合性含 氮 化合物。蛋 白膝吸温性 很强.易溶于水.是两性化合物.具有一定缓 冲作 用。但因所用蛋 白膝的品种 不同.水解的 酶类和产 物不一,以及梢制的方法各异,蛋 白膝 的具体成 分、质量及适 用对象,都有较大差 别,故其效果很不一致.例如,酸或 碱水解 的陈类,由于许多 氨基 酸受到破坏或者 构型改 变,以致培 养或鉴定 细菌的效果最差,此类陈因无 色氨基酸,不可能有靛基质与霍乱红 反应;用 胃蛋 白酶 水解 的产物,适用 于多种肠道致病菌 的分离培养;胰蛋白酶或真菌蛋 白酶 水解的 蛋 白产物,但前者为适碱性酶,水 解 力稍差,肤及氨基酸 的含量相对较少,后者为中性蛋 白酶,水解力强,肚及氨基酸 的含量较多,两 者均 适 用 于 多种 细菌及霉的 各种 类培养 基,如胰酶酪蛋 白陈 和真菌蛋 白膝鱼粉陈等;用肠肤 酶水解的衍生物,肚 及 氨基酸的含 量则更多,但原料难得、手续 繁 杂、产品极少。一般常用的陈,有 马丁氏胃陈;胰陈有酷蛋 白陈、肉陈、筒骨陈、血陈和鱼 粉陈等;真菌酶或 木瓜酶水解的陈类,则有鱼 粉陈和大 豆蛋 白陈等。大豆蛋白陈或其它植物蛋 白陈特别适 宜霉菌 的生 长繁殖。总之,各种蛋 白脏均有 其不同 效果,使用前 应做生化及细 菌学 的质 量检 验,符合规定 的标准时再选购 备用为宜。4、葡 萄搪等碳水化合物葡 萄糖 是很多 微生 物能量的主 要来源,也是合成 菌体 中的糖类、脂类、氨 基 酸、嗦吟和 啥 徒等有 机物的碳源.在培养基 中加入0.1一0.5%的葡萄糖,对多种徽生物都能改善 能源,起促 进生 长的作用。但不同的 微生物对糖类 的 需要 差别 很大,很 多微生物尚需要其 它单 糖、双糖、多 搪或 淀粉,以及多 种有机酸或脂类等作为碳 源或能源.自养微 生物以二 氧化碳或碳酸盐为唯一碳 源,合成 碳水化合物,进而 再合成蛋白质、核 酸和类脂等细 胞物质。二氧化碳是被 彻底氧化的 物 质.从二氧化碳转化成有机物 是一个还 原过程,需要能 量,自养 微生物 的能 源是光 能或 氧化无 机物(NH3、HZS、S、Fe,一等)所释放 的化学能。引起 金属管道腐蚀的氧化硫杆 菌和氧化铁硫杆 菌就是这 类微生 物。化能异养 微生 物以有 机 碳 水化合物 为碳源和能 源,例如糖类、醇类、有机酸、脂肪、烃类等等,其中糖类是最好的碳源.在单搪 中,以已糖的利 用最为普遍,几乎每种微 生物都能 利 用葡萄搪和 果糖;甘露搪或半乳糖虽能利用,但一般较为缓慢;其 它已搪 能否 被 微 生物所 利 用,主 要决定 微生物体内有无把它 们转化为葡萄糖或果搪的酶系。戊糖如木搪、阿拉伯搪的利用不 如已糖普遍,但对少数真菌较为适宜。双糖中蔗糖和麦芽糖是微生物普遏能利用的碳源。蔗糖浓度为1一3%时,是多数微生物理想 的 碳 源和能源,浓度为1 0%时,一些 微 生物受抑制,而另一些微生物要提高到40一5 0%时才受到抑制,甚者在60w e一80%的搪液中还能生长,如花蜜酵母和某些霉菌,它们常是 蜜饯食品腐坏的原 因.多 糖是单糖或其衍生 物的聚合物,广 泛存在 于谷物、食品、纤 维制品 中,其中淀 粉是大多数真菌都能 利 用的碳源。多搪一般是不溶于 水 的大分子,难以通过霉腐徽生物 的 细胞膜,因此 在多糖被利用之前,霉腐微生物 先分 泌相 应胞 外酶,使 多糖分解为可通过 细 胞膜的 小分子物质。淀粉类食品在保存时间较长时,容易霉变腐败。果胶也可被多种徽 生物分 解利 用、如耐 热性纯黄丝 衣霉(B yssoeh lamysfulva)可分解水果雌头中水果的果胶而造成雄头的腐坏。醇类 中甘露醇和甘油可作 为微生物 的碳源 和能源。在许多化妆品 中,甘 油 是基 本原料,因此化妆品也往 往容易被微生物污染。低浓 度的乙醉可 被某些酵 母 菌所利 用,因此低浓度的酒类也常常引起腐败。脂肪酸中,如 甲酸、乙酸、丙酸和 丁酸等低级脂肪酸,它们的 利用率都很低,甚至表现有毒性。亚 油酸和 油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为 碳源和能源利用,低 浓度和高级脂肪 酸可刺激细 菌的 生 长,但浓 度较高时往 往对微生物 有抑制作用.许多微 生物还 可以利用 石 油及烃类化合物作 为 碳源和能源,这些 微 生物可引 起石油一81一及 其制 品的污染.降低它们 的燃烧放 能。5、氛化钠等无机盐类微 生物的生长需要一 定的无机 盐类。一般在培养基中常加入0.3一0.7%的 抓化 钠.它可调节培养基的渗压,供给钠离子,维持菌体细胞 的等渗作 用,激 活菌体中的酶,促进细菌的繁殖 生长。无机盐类在微生物生命活动中的主要功能有:构 成菌体的成分;作为辅酶 或酶的组成部分或维持酶的活性;调节细 胞渗透压、氢离子 浓 度、氧化还原电位等;某些 自养微生物 可以利用无机盐 作为 能源.无机盐包括主要 元 素 和 微 量 元 素两大类:主要元素有钠、磷、硫、镁、钾、钙、铁等;微量元素有铜、锌、锰、相、钻、硼等.各种元素 的功 能简述 如下:(l)钠调节 细 胞 和培 养液的渗透 压,调 节 固体培养基的 水分 活性,并 且 有激活细 胞 外 阳 离子和调节代谢活动的功能。(2)钾.是许多 酶 的激 活剂,具有促进 蛋 白质 和糖的合成作用。钾 可以控 制细 胞质的 胶态和细胞膜的通透性。(3)磷菌体中含磷量较高.磷代谢转化中的 磷酸化过程,生成高能 磷酸化合物.高能磷酸键有贮存和运 送能量 的作用.磷酸盐又是重要的缓冲剂之一。(4)硫硫是蛋 白质组成 中的某些氨基 酸的组成部分。许多在代谢 中起重要作 用的辅酶(如辅酶A、生物素、焦磷 酸硫胺素、硫辛酸等)中都含有硫.硫 或硫化物(HZS,5203等)是 自养硫化细菌的能源。而硫 酸盐是硫酸盐 还原 细 菌能量代谢中的电子受体.(5)镁镁是微 生 物体 内一些重 要 酶,如已糖磷酸化酶、异柠 檬酸 脱氢酶、肤 酶等酶的激活剂。镁 也是光合细菌 菌绿 素的 重要组成 部分.一8 2一镁 还 对 某些 霉 菌 的分 生饱子形成 有 刺激 作用.此外,镁在细胞 中还起着 稳 定核糖体、细胞膜和核酸的作用。(6)铁铁是细 胞 色素、细胞 色素氧化酶、过 氧化氢酶或过氧 化物 酶 的 辅 酶铁叶 琳 的组成 部分,在氧化还 原反应 中具有传递 电子的作用,是微 生物代谢 中 转化能量 的 一个重要元素,铁也是某些 酶、如乌头酸酶 的激 活剂.(7)钙钙是某些酶如蛋 白酶的激活剂,还具有降低 细胞 质的 透性,调 节酸度和中和其它阳离子的危害等 作 用;钙还 是 芽 胞的 重 要组 成部分,在细 菌芽胞耐 热性方 面起 着关键作用。(8)其它微量元素锌、钥、锰、钻、镍、铜、碘、澳、钒等元素,微生物需要 量十分 微小,但又不可缺少,它 们参与 酶蛋 白的组 成,或是许 多 酶的激活剂。如钻是 维生 素BI:的 成 分;锰是多种酶的 激 活剂,也是 黄嗦吟氧 化酶的组成部分;铜是一些酶的 组成 成分,例如 多酚 氧化酶和抗坏血 酸氧化 酶等都是含 铜的 特殊蛋 白,又与霉菌的抱子形成 有关;锌 是乙醇 脱氢 酶和乳酸脱 氢酶等的活性基,许多酶 活性 也 靠锌激活;钥与钒能 促进固氮作用。在 实验室 中,合成培 养基、半合成培养基培 养 霉菌 时,一般需 加入磷、硫、钾、镁、铁等元素,通 常以K:H pO;、K卜 IZpO;、MgSO.及FeSO;等的形式 加入,以满足霉菌对这几 种主要无机盐元 素的需要。6、生 长素有 些微 生物 在 生 长繁殖过程中,特别 需要一些 微量有机 物作 为生 长素。广义的生长素包括氨 基、嗦吟、啥咤、维 生 素等,狭义的生长素主要 指B族 维生 素,这 些 物质大多都是辅 酶 或辅基的组 成成 分,通常在 新鲜酵母 或酵母 浸膏 中 含量 较高,故常 用以加在培养基中作 为补充一般用量 为0.5%。血液、血清、腹水以及心、肝、脑的 浸出液和卵黄液 等.都含有可 刺激 多种细 菌 等微生物发 育繁殖的生长 因子。在天然 植物中,如土豆、玉米、谷类、豆类、蔬菜等,都含有丰富 的生长素,即使是需要 生 长素的霉腐微生物 也能良好生长繁殖,所以常用马铃薯培养(PD A),玉米粉培养基来分离、培养霉菌.7、水分培 养基中不可缺少水,所有生活的菌体细胞都需要水。水是微生物体的重要组成部分。在代谢过程中也占有极重要的地位。水是良好的溶剂,可溶解各种营养物质供微生物吸收利用,并可调节生理环境,便于徽生物进行分解、合成、分沁及排泄等新 陈代谢作用;水还直接参加代谢反应,作为生 化反应之一;水还是原生质胶体的组成部分。配制培养基时,必须用燕馏水,因为自来水、井 水及河水中因 含多量的钙、镁离子,遇到 蛋 白陈与肉浸液中的磷酸盐时,加热常可产生沉淀,影响培养基 的质量。8、明胶明胶是动物的胶原组织,如皮和 肌健等都可制成明胶。它的主要成分为蛋白陈,但缺乏游离氨基酸,所以营 养价值不大。明胶制成的培养基在2 4以上能溶解,2 0以下凝固,所以接种细菌后,不能在3 7下培养。某徽 生物能使明胶分解而液化,故明胶通常不用做凝固剂,而作为鉴别培养基。9、琼脂琼脂是 用石 花菜等海藻 类 植物,经加 水煎熬,提取 精制,脱水干 操而制成的条状、片状或粉未状的胶体物 质,按溶液量的1.5一2.。%加水 加热 煮融熔后,放冷即 可凝固。琼脂在培养基 中无任何营养作用,只供培养基作平板 或斜面的固形剂,以供各种傲生 物能在 固体表面上按其群体特征生长 繁殖的 良好基地,因 而固体培养 基不可缺 少的重 要成分。质量比较纯净、胶性适度的琼脂,按常量加在蒸 馏水 中,经加热 煮数分 钟极 易融化,冷至4 OC时又可凝固,硬度适宜者均属合格产品,如能与优质蛋 白陈 混合加热融化,溶液澄清,调节酸碱度再加热灭菌后仍无 沉淀者,质量更好,可作干操琼脂培养基 用。琼 脂在 炎热的夏季用量适量增多;培养基含盐量过 高,也应增加琼脂的用量;培养基PH值低 于4.5以下时,加热融化后不再凝固;反复高温加热凝固力也明显下降,可影响使用效果。二、有鉴别指示作用的成分分析常用于 鉴别徽生物不同生化特性的各种培养基,除基础营养成分外,根据鉴别的内容和 目的不同,常加有以下成分。1、PH指示剂为 了观察 各种 细 菌对搪、醉和昔类等聆水化合物的发 醉反应,常在培养基内加有定量的PH指示剂,用以判别发醉 后的产酸现象。如培养基由弱碱性或中性变为酸性时,指示 剂也随之变色;另外也可 用以鉴 别氧化还原而 显示的颜色。常用的指示剂有酸性复红、澳 甲酚紫,澳察香草酚蓝、酚红、中性红、碱性复红、甲基红及伊红美蓝混合指示剂等,可根据PH值的指示范围与作用不 同而选用。2、糖、醉、昔类因为各种 微生物 细胞所产 生的搪类分解酶不同,故其发酵发应也不相同.根据鉴别不同种属细菌的需要,常在培养基中分别加入各种撼、醉和昔类等碳水化合物,除用以鉴别细菌发酵之外,也是供细 菌生长发育的能淤、和碳源。3、有机酸盐类有些 细菌的酶可将复杂的有机 酸、如酒石酸,拘摊酸或枯液酸等,分解为乙酸、草酸、唬拍酸及乳酸等较为简单的有机酸,以致培养基的电离度增 加,PH值随之下降,使指示剂的颜色改变,并可与铅离子形成铅盐沉淀,藉以判定阴性或阳性反应.另外尚可用丙二酸钠、马尿 酸钠、醋 酸盐及葡萄搪胺、构 摊酸胺等作为碳源或氮源,测 试细菌能否利用其生长或者 分解的鉴别试验.4、氨基酸与蛋 白质如侧 定一些细 菌能否分解蛋 白陈 中的色一83一氨 酸、肤氨酸 或半 肤氨 酸.产生靛基质、霍乱红和硫化氢反应,测试细 菌有 无苯 丙 氨酸 脱氢酶、精 氨 酸双解酶、赖 氨酸或 鸟 氮 酸脱梭酶,以及尿素酶 和 明胶、肉渣 的 蛋 白水解酶等,常在培 养基中 加入含有相 应成分的蛋 白膝、氨基 酸、尿素以及明胶等作各种试验。另外还 有专以牛 乳 或石蕊牛 乳 作培养基,侧试细 菌对牛乳 的分解 产 酸、凝 固、炼化等鉴 别试验。5、其它鉴 别成分如测试 细 菌能否产生 脂酶、磷酸 酶等各种酶类,在培养基中可分别加入适量的 卵磷脂(或卵黄)、磷 酸醋、甘油三丁 酸醋、吐温等,作相应的酶类水解试验。此外,尚有维生素及生 长因子的代谢试验,硝 酸盐还原或亚硝 酸盐分 解产 氨试验等,均 可 在培 养基 中 加 入 或调节 有关成分,做各种鉴别试验。三、有迭择性的抑 菌成分分析为分离鉴别细 菌 及其它微 生物,常在培养基中加入一些有选 择性 的抑菌剂.用以鉴定 细 菌或 抑制杂 菌 的生 长 繁殖,增 加待检菌的 检 出效 果。常 用 的抑 菌剂有以下几类:l、各 种盐类常用 的盐类有氮化钠、抓化 铿、氛化钾、亚啼酸 钾(钠)、亚硒酸钠、亚硫酸 秘 和四 硫成酸 钠等,其用途和作用原理 各有不 同.2、有机 染 色剂常用 于肠 道 菌 培养 基 的有煌绿、蔷薇 酸和结晶紫;用于结 核菌 的有孔 雀绿;用于鉴别布 氏杆 菌的有硫茧等、沙黄等;用于分 离霉菌的有孟 加拉红(虎红)等。3、胆汁 及胆盐常用的有猪、牛、羊的胆汁原 液,以及 用以制成的各种胆汁 酸盐精制的牛 磺胆 酸盐、甘 氨酸 盐、去 氧胆酸盐 和胆石酸盐及混合胆盐等,对不 同 的菌 类有 不同的 溶 菌或抑 菌 作用,藉以鉴别某些球菌、肠 道杆 菌或者 抑制一些革 兰氏阳性 菌类等二4、杭生素类在细 菌和 其它微生物 的检 验工作 中,也一84一常用一些抗生素,如青霉 素、庆大 霉 素、氯霉素、链霉素、双氢链霉 素、多枯菌素、丝裂霉 素或杆 菌素等,适 量 加在培 养基中 供作 抑 菌试验、研究 抗菌培菌谱及分离鉴别某 些菌种等。在进 行 霉菌计数时,培 养基 中 加入抗生素可以有效地 抑 制细 菌和酵母菌 的生长,防止细 菌和酵母 菌与霉菌竞 争营养 成分,以便增 加霉菌的生长 速度.提高检出率.5、其它抑菌 试剂例如 可用于抑 制细 菌蔓延及多 种肠道菌生 长繁殖的氯化三 苯四氮哇(TTC);用以鉴别肺炎链 球菌的乙基氢化铜蛋白(E thyl hy-drocuprein e一HC LOptoehin);用 于抑 制 弧菌 的二氨基 二异 丙基蝶咤(2,4一D iam i n o一6,7一 diis opr opylp一teridin e即o/129抑 菌试验);以及用于分离鉴别绿脓杆 菌的十六烷三 甲基澳化按(c it r im id e)和用于抑制 细菌 的抓硝 按(2.6一diehloro一4一nitro a niiin e.Di-choran)试 剂等.四、有特殊作 用 的成 分分析在药品、生物制 品及血液制剂 的检验中,为解 除样 品 内不 利于细 菌生 长的物 质因素,常 在 培 养基中附加一些 有特殊 作用的成分,以便提高 检 出效 果。例如加适量对氨基苯 甲酸以解脱 磺 胺药物 的抑 菌作 用,加硫 酸镁可破坏血 液 中 的抗菌素,加Ringer或Tyrode氏溶 液可 平 衡各种盐 类 对细菌的 毒性,在 专性厌 氧菌 的培 养 基 中加硫乙醇 酸 钠,不仅可吸氧、降低氧化 还原 电势.尚可 中和汞离 子的杀 菌 作用.在肉汤中加入适量 小肝 块 或碎肉渣,或 者 加蛋 白及 氯化 钱、二氯 化 钙等,可以降低 或 中和很多重 金属离子对细 菌的毒性作用。参 考 文 献1马振魂、李 象洪、陈枪雄偏着:防霉学,29一5().19 90。【2孟昭赫主 偏:食品卫生检验方法注解.贵 生 物学邵分.人民卫生出版社,落20一434.199。3无锡轻工 业学院、夭沪幸轻工 业学院:食品做生 物学,轻工业出版桂.,1一1 2 6.1,87.【4苏世歹:真 菌培 难原理兮析与应 甲,彭城大学学报.l()()一l()8,3一4.19 92。