湖南省“三热”病人血检工作方案.doc

湘卫疾控发〔2011〕15号

湖南省卫生厅关于印发
《湖南省“三热”病人血检工作方案》的通知

各市州卫生局，省疾病预防控制中心：
为贯彻落实《湖南省2010—2018年消除疟疾行动计划》，提高我省“三热”病人（临床诊断为疟疾、疑似疟疾和不明原因的发热病人）血检工作质量，及时发现疟疾病例，有效控制传染源，确保2017年全省实现消除疟疾的目标，我厅组织制定了《湖南省“三热”病人血检工作方案》，现印发给你们，请遵照执行。

二O一一年七月二十八日

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湖南省“三热”病人血检工作方案

疟疾曾是严重危害人民身体健康和生命安全、影响社会经济发展的重要寄生虫病，经过50年防治，至2002年我省122个县市区达到卫生部颁布的基本消灭疟疾标准，取得了显著成绩。根据卫生部等13个部委局《关于印发〈中国消除疟疾行动计划（2010—2020年〉的通知》（卫疾控发〔2010〕47号）精神以及省卫生厅等13个厅局《关于印发〈湖南省2010—2018年消除疟疾行动计划〉的通知》（湘卫疾控发〔2010〕24号）要求，我省决定从2010年起全面开展消除疟疾工作，到2017年全省实现消除疟疾的目标。各级各类医疗卫生机构应开展对临床诊断为疟疾、疑似疟疾和不明原因的发热病人（以下简称“三热”病人）进行疟原虫镜检，以最大限度地及时发现疟疾病例，加强传染源控制和管理。为切实做好“三热”病人血检工作，确保到2017年全省实现消除疟疾的目标，特制定本工作方案。
一、目的
规范“三热”病人疟原虫血检工作管理，确保血检工作质量，及时发现病例和有效控制传染源，为消除疟疾提供科学依据。
二、血检对象
“三热”病人均为疟原虫血检对象，特别是从非洲、东南亚等疟疾流行国家和地区归国人员和来自疟疾流行区的流动人口中的发热病人是重点血检对象。
三、血检工作指标
二类县以乡镇为单位“三热”病人年疟原虫血检的总数不低于辖区人口数的1%；三类县“三热”病人年疟原虫血检的总数不低于辖区人口数的2‰。疟疾传播季节血检人数不低于年血检总人数的80%。
四、血检方法
“三热”病人的血检方法参照《疟疾诊断标准（WS259-2006），附录C（规范性附录）病原学检查》（见附件1）。
五、组织管理和职责分工
（一）省级
1、制订全省“三热”病人血检工作年度计划，并提供技术支持和指导。
2、负责对各市州、县市区实验室人员进行疟原虫镜检技术培训。
3、负责对各市州、县市区实验室的镜检能力进行考核评估；疟疾实验室的质量控制和考核认证，并为各市州、县市区疟疾实验室网络的建设提供技术支持。
4、定期或不定期对各市州、县市区实验室的检测结果进行抽样复核。
5、建立疟疾病原学和分子生物学参比实验室，负责全省疟疾病原学确认和基因检测。
（二）市州级
1、负责制订本辖区的“三热”病人血检年度工作计划。
2、根据需要有计划地对本辖区实验室人员组织镜检技术培训。
3、负责对本辖区各县市区“三热”病人血检工作检查督导，并抽查复核2%以上阴性血片和复查全部阳性血片。
4、建立疟疾病原学实验室，为辖区内各县市区提供技术支持和指导；并对其实验室的镜检能力进行考核评估。
5、督促各县市区“三热”病人血检工作进度，按月收集、汇总各县市区“三热”病人血检工作统计资料，及时上报。
（三）县级
1、制订辖区内“三热”病人血检工作计划、实施方案、奖惩及考评制度。
2、负责对辖区内县级医疗机构、乡镇卫生院、社区卫生服务中心镜检人员开展技术培训，要求为每个县级医院、乡镇卫生院、社区卫生服务中心至少培训1名镜检人员。
3、负责对辖区内县级医院、乡镇卫生院、社区卫生服务中心的“三热”病人血检工作进行检查督导，每季度1次。检查血涂片质量，并复核5%以上的阴性血片和复查全部阳性血片；检查各级血检站显微镜质量、染色液试剂等设施；考核检验人员显微镜使用和维护能力。
4、建立疟疾病原学实验室，对辖区内县级医疗机构和乡镇卫生院、社区卫生服务中心提供疟原虫镜检技术支持和指导；以及对其实验室的镜检能力进行考核评估。
5、县级疾控中心在疾病监测信息报告管理系统中发现疑似、临床诊断和确诊的疟疾病例后，应当立即与责任报告单位联系，对报告病例的血涂片进行复核。并在使用抗疟药前采集滤纸血膜（血量约40μl，直径为2cm，标注病人姓名、采血日期、疟原虫种类），自然干后用塑料袋加入干燥剂包装，置于-20℃冰箱保存；同时取静脉血2ml加抗凝剂置于-70℃或-20℃冰箱保存。将患者血涂片、滤纸血膜、抗凝血和个案调查表尽快寄送至省疾控中心进行病原学确认和基因检测。滤纸血样寄送时应避免高温，需加放冰袋。
6、验收血片。负责收集县级医疗机构和乡镇卫生院“三热”病人的血片和血检登记表，检查血片质量、完成任务数和血检表的登记情况，每月1次。已验收的血片和血检登记表全部保存在县级疾控中心备查。
7、汇总各乡镇血检人数、阳性人数，于次月10日前上报市级疾控中心。
（四）县级医疗机构及乡镇卫生院、社区卫生服务中心
1、建立“三热”病人血检制度和疟原虫镜检站，至少有1—2 名专职或兼职检验人员负责“三热”病人血检工作。
2、全年对就诊的“三热”病人、从高疟区返乡的所有当地居民中的发热病人应制作厚、薄血膜1张，采用吉氏染色。
3、所有“三热”病人血检对象应及时登记，血检对象要求逐项填写血检登记表，血片应按顺序编号。发现阳性应立即报告临床医生和同级防保组织。
4、各镜检站应保存全部的阳性血片和阴性血片，以备上级复核。
5、做好显微镜日常养护及试剂的配备。
6、“三热”病人的血片和血检登记表于次月5日前上交县市区疾控中心验收。
六、评价指标
（一）血检指标完成率要求达到100%，按每单位（县或乡镇）血检任务分配数÷实际完成血检人数×100%计算完成率。
（二）血涂片制作合格率、染色合格率和清洁度合格率均在90%以上。分别以（好片+中片）÷每单位（县或乡镇）抽检血片总数×100%计算血片制作、染色和清洁度合格率。
（三）阳性血片错检率不超过10%；阴性血片漏检率不超过0.01%。错检率按每次复查阳性片总数计算（错检血片数/所有复检阳性血片数×100%）；漏检率按每次复检阴性片总数分别计算（检出阳性血片数/所有复检阴性血片数×100%）。
（四）镜检人员接受疟原虫的培训率要求达到100%。
七、质量控制
（一）培训。省疾控中心每2年对市级和县级疾控机构、医疗机构疟原虫镜检技术骨干进行培训1次。县级疾控机构每年对乡镇卫生院、社区卫生服务中心和县级医疗机构疟原虫镜检人员技术骨干进行培训1次。
（二）督导
1、省卫生厅负责组织省级专家组对各县市区“三热”病人血检工作进行检查督导，每年1次，抽查复核1%的阴性血片和全部阳性血片。
2、市州卫生局负责对辖区内各县市区“三热”病人血检工作进行检查督导，每县每年至少督导2次。检查血涂片质量，每次每县抽取5%的阴性血涂片和所有阳性血涂片进行复核。
3、县市区卫生局负责对县级医院、乡镇卫生院、社区卫生服务中心“三热”病人血检工作进行检查督导。督导内容包括: 厚薄血膜制作、染色和镜检质量，要求各项指标合格率达到90%以上；抽查频次：在疟疾传播季节每月开展1次，非传播季节每季度开展1次。每次抽取5%的阴性血涂片，最少抽取10张血涂片，不足10张者全部检查。
（三）镜检质量控制
1、病例的镜检复核和确认。县级疾控中心在疾病监测信息报告管理系统中发现疑似、临床诊断和确诊的疟疾病例后，应及时对报告病例的血涂片进行镜检复核。对镜检复核阴性的“临床诊断病例和确诊病例”血片，及该病例的滤纸血片送省级疾病预防控制机构进行进一步镜检复核和基因检测。
省疾控中心对全省各地网络报告的疑似、临床诊断和确诊的疟疾病例的血涂片进行镜检复核，其中对疑似病例镜检复核阴性的予以排除，对临床诊断和确诊病例血涂片镜检复核结果为阴性的病例进一步进行基因检测，对基因检测为阴性的病例予以排除，并将复核结果反馈当地疾控中心。
2、血涂片制作和染色质量考核。省、市、县各级疾控中心定期对辖区内医疗机构进行血涂片镜检质量抽查考核，进行厚、薄血膜制作、染色质量考核，评分办法详见附件2。
八、报表和资料管理
（一）各级应指定专人负责血检工作报表的收集、审核、汇总上报工作。各级收到下级报表后，应立即核实报表的及时性、完整性、准确性、真实性，并审核数据间的逻辑关系，如先后上报纸质报表、电子报表，须核查两者的一致性。审核中遇有疑问或问题，应立即与下级沟通，问题严重者应限期重新上报。各级还应定期开展报表数据现场抽查核实，一旦发现存在弄虚作假、谎报等现象，应通报批评。
（二）各乡镇卫生院、社区卫生服务中心、县级医疗卫生机构必须保存全部“三热”病人血片、血检登记表。血检登记表在全年工作结束后交县级疾控中心归档保存。所有阳性血片由县级疾控中心保存；阴性血片由乡镇卫生院和县级医疗机构保存半年，经上级验收同意方后可清洗。
（三）报表上报
1、乡级卫生机构于每月底将“三热”病人血片和血检登记表进行清理，核对血片编号与血检登记表编号的一致性，按统计表要求进行统计，于次月2日前将报表上报县级疾控中心。
2、县市区疾控中心月报。每月结束后，于1周内收集汇总上月报表的数据，经审核确定无误后，以纸质表和电子表及时上报市州疾控中心；同时将乡级报表作为附件。
3、市州疾控中心季报。每季度结束后，两周内收集汇总上季度报表的数据，经审核确定无误后，以纸质表和电子表及时上报省疾控中心；同时将各县市区的月报表作为附件。
4、省疾控中心半年报。每半年结束后，于两周内收集汇总前半年报表的数据，经全面审核确定无误后，以纸质表和电子表及时上报卫生部疾病控制局血吸虫病处；同时将市、县两级报表作为附件。
附件：1、“三热”病人的血检方法
2、疟原虫血片制片染色技术考核评分表
3、“三热”病人血检工作督导检查表
4、“三热”病人疟原虫血检记录表
5、“三热”病人疟原虫血检统计表
6、疟原虫血片镜检复核记录表
7、疟原虫血片镜检复核统计表

附件1：
“三热”病人的血检方法

一、血涂片的制作
用1次性采血针在耳垂或指端采血，婴儿可从拇趾或足跟采血。取血在表面洁净、无刮痕的载玻片上涂制薄血膜和/或厚血膜。用推片的左下角刮取血液4μl～5μl，再用该端中部刮取血液1.0μl～1.5μl。将左下角的血滴涂于载玻片的中央偏左，由里向外划圈涂成直径0.8cm～1cm的圆形厚血膜。厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5个～10个白细胞为宜。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两张玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。
二、染液的配制
（一）吉氏（Giemsa’s）染液配制。吉氏粉5.0g、甲醇250ml、甘油50ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗清研钵中甘油为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温内，每天用力摇动溶液5min，3d后即可使用。也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3mm～5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，塞紧瓶塞，置于室温内，每天用力摇动5min，3d后即可使用。
（二）瑞氏（Wright’s）染液。瑞氏染剂粉1.0g、甲醇500ml、甘油15ml。 将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5min，3d后即可使用。
（三）染色用水。常用的染液稀释和冲洗用水是中性蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。在没有蒸馏水时，也可用井水、河水、泉水或雨水。稀释和冲洗用水的pH在7.2时，染色效果最佳。因此，也可选用临时配制的PBS缓冲液，以取得较好的染色效果。
（四）PBS缓冲液的配制（0.01mol/L PBS pH7.2）：
KH2PO4 0.38g
NaHPO4 1.02g(或Na2HPO4 ·12H2O 2.58g)
NaCl 8.00g
蒸馏水加至 1 000ml
三、染色
可用吉氏或瑞氏染色法染色。推荐使用吉氏染色法。
（一）吉氏染色。先用甲醇固定薄血膜。成批染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对载玻片血膜朝外插入染色缸中，倒入新配制的2%吉氏染液（2ml吉氏原液与98ml蒸馏水或PBS缓冲液混匀）浸没厚、薄血膜，30min后，向染色缸中注入自来水或PBS缓冲液至溢出，除掉染液表面浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2次～3次，然后取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上晾干。单张血膜染色可取蒸馏水或PBS缓冲液2ml加入吉氏染液1滴～2滴，混匀后滴在厚、薄血膜上，20min～30min后，水洗、晾干。
（二）瑞氏染色。用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液5滴～8滴，染色1min～2min。然后再加5滴～8滴蒸馏水于薄血膜上，用吸管将染液与蒸馏水混合均匀后，把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10min。用清水轻轻冲去染液，晾干。
（三）血涂片检查。在染色后的血膜上加一滴香柏油，用光学显微镜油镜检查。以检查厚血膜为主，薄血膜主要用于虫种鉴别。着色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红色，嗜中性粒细胞核呈紫蓝色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈红色。除环状体外，其他各期均可查见疟色素。疟原虫形态见表1和表2。以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。根据疟原虫形态确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟或混合感染。

表1：
四种疟原虫薄血膜形态鉴别（吉氏染色）

间日疟原虫
恶性疟原虫
三日疟原虫
卵形疟原虫
被寄生
红细胞
大小
形状
颜色
斑点
胀大

褪色
薛氏点出现稍晚，红色，细小数多
正常

正常或稍紫
茂氏点红色，粗大数少
正常或缩小

正常
齐氏点淡红色，微细
正常或稍胀大
卵圆形或边缘呈伞矢状
褪色
薛氏点出现较早粗大，数多
小滋
养体
(环状
体)
大小

核
胞浆

色素
较大，约占红细胞
直径的1/3

1个
较薄

无
小环状体较小，约占
红细胞直径1/6, 大环
状体与间日疟原虫相似
1或2个
小环状体纤细，大环状体与间日疟原虫相似
无
中等

1个
较粗厚

偶见细小褐色颗粒
中等

1个
较粗厚

无
大滋
养体

大小
核
胞浆
色素
色素
较大
多见1个
阿米巴样，常含空泡
黄褐色，细小，杆状，散在分布
较小
1或2个
圆形，空泡不显著
黄褐色，细小，结成
团块后，呈黑褐色
较小
1个
带状，空泡不显著
深褐色，粗大，沿边缘分布
较小
1个
圆形，空泡不显著
棕黄色，较粗大
未成熟
裂殖体

大小
核
胞浆

色素
较大
2个以上
圆形或不规则，空泡
消失
黄褐色，分布不匀
较小
2个以上
圆形，空泡消失

黑褐色团块状
较小
2个以上
圆形，空泡消失

深褐色，分布不匀
较小
2个以上
圆形或卵圆形，空泡消失
棕黄色，分布不匀
成熟
裂殖体
大小
裂殖子

色素
大于正常红细胞
12～24个，常为16～18个，排列不规则。裂殖子较大
黄褐色，常聚集一侧
小于正常红细胞
8～26个，常为8～18个，排列不规则。裂殖子较小，
黑褐色团块
小于正常红细胞
6～12个，常为8个，常排列如菊花状。裂殖子较大
深褐色，常聚集中央
小于正常红细胞
6～14个，常为8个，排列不规则。裂殖子较大
棕黄色，聚集中央或一侧
雌配
子体
大小
形状
核

胞浆
色素

大于正常红细胞
圆形
1个，较小，深红色，
位于一侧
深蓝色
黄褐色，均匀散在
较大
新月形，两端尖锐
1个，较小，深红色，
位于中央
深蓝色
黑褐色，紧密分布于
核周围
小于正常红细胞
园形
1个，较小，深红色，位于一侧
深蓝色
深褐色，均匀散在
小于正常红细胞
圆形
1个，较小，深红色，
位于一侧
深蓝色
棕黄色，散在
雄配
子体
大小
形状
核

胞浆
色素

大于正常红细胞
园形
1个，较大，淡红色，
位于中央
浅蓝色
黄褐色，均匀散在
较大
腊肠形，两端钝园
1个，较大，淡红色，
位于中央
浅蓝色或淡红色
黑褐色，松散分布于
核周围
小于正常红细胞
圆形
1个，较大，淡红色，位于中央
浅蓝色
深褐色，均匀散在
小于正常红细胞
圆形
1个，较大，淡红色，
位于中央
浅蓝色
棕黄色，散在

表2：
四种疟原虫厚血膜形态鉴别（吉氏染色）

间日疟原虫
恶性疟原虫
三日疟原虫
卵形疟原虫
小滋养体
（环状体）
较大。核1个，较大，胞浆较厚。常呈"！"或"，"状
较小。核1～2个，较小，胞浆纤细。常呈"！"、"飞鸟"、"V"和"断环"状
中等。核1个，较大，胞浆粗厚。常呈 "环状"或"鸟眼"状
大小与间日疟原虫相似，胞浆致密，核较大。
大滋养体
较大。呈阿米巴样，形状不规则。核位于胞浆之中或外边，胞浆常缩成圆形或断裂成数块。
色素分布不匀
较小。常呈圆形，色素细小或结成1～2个团块
中等。常呈圆形，色素粗大
大小与间日疟原虫相似，胞浆呈深蓝色，核较大
裂殖体
较大。裂殖子12～24个。
裂殖子较大
较小。裂殖子8～26个。裂殖子较小
较小。6～12个。裂殖子大于间日疟原虫裂殖体
大小与间日疟原虫相似，裂殖子6～14个，核较大
配子体
较大。圆形，色素粗大。雌配子体较大，核小，胞浆深蓝色，雄配子体较小，核大，胞浆浅蓝色
雌配子体新月形，雄配子体腊肠形
与间日疟原虫相似，但较小。色素较粗大
卵圆形，大小与间日疟原虫相似， 雌配子体核致密，偏于一侧，雄配子体核疏松
色素
黄褐色，细小。杆状，或结成粗大颗粒。分布不匀
黄褐色，颗粒细小，结成团块后，呈黑褐色。配子体色素粗大，分布于核周围
有时小滋养体可见色素，深褐色，较粗大。沿边分布
色素颗粒较大，呈深棕色，分布弥散
被寄生红细胞
常见红细胞“影子”和薛氏点
可见红细胞“影子”和茂氏点
可见红细胞“影子”
小滋养体时即可见薛氏点
其他
常可查到各阶段的疟原虫
仅见小滋养体(或)和配子体。一般不见大滋养体和裂殖体
常可查到各阶段疟原虫
常可查到各阶段疟原虫

附件2：
疟原虫血片制片染色技术考核评分表

项 目
检查内容
质量标准
考核分值

分值

分值

分值

血片制作
（80分）
厚血膜（40分）
血量（10分）
4～5цl
10
略多或略少
7
过多或过少
5

位置（10分）
玻片右1/3
10
稍偏右
7
偏右过多　
5

直径（10分）
0.8～1.0cm
10
0.7～0.8 或1.0～1.2cm
8
<0.7或>1.2cm
5

外观（10分）
圆形厚膜均匀，边缘整齐
10
圆形稍不均不整齐
8
厚薄不匀影响着色
5

薄血膜（40分）
血量（10分）
1～1.5цl
10
略多或略少
7
过多或过少
5

位置（10分）
玻片1/2～1/3处
10
稍偏右或偏左
7
偏右或偏左过多
5

直径（10分）
2.5～2.0cm
10
稍大或稍小
8
过多或过少
5

外观（10分）
舌状厚薄均匀，无划痕
10
舌状稍不均
8
厚薄不匀呈波浪型，有划痕
5

血片染色质量（10分）
外观（10分）
厚血膜完整
10
厚血膜半脱落
5
厚血膜全脱落
2

血片清洁度（10分）
外观（10分）
光洁无油灰
10
稍有油污
5
油灰粘连
2

复核人员： ； 复核日期：

附件3：
“三热”病人血检工作督导检查表

被督导单位

督导日期

督导方式

被督导单位签收

督导内容
是
否
备注
1. 有书面计划、方案、安排

2. 已开展

3. 已完成

4. 镜检站运转正常

5. 血检登记齐全

6. 血片制作规范

7. 血片染色规范

8. 全部阳性血片保存

9. 阴性血片保存

10.有血片抽检、反馈记录

11.抽查发热病人与血检登记相符

建议：

上次督导建议执行情况：

督导单位： 督导员： 督导单位负责人：
注：此表一式二份，一份存被督导单位，一份存督导单位。

附件4： “三热”病人疟原虫血检记录表
省 市 县（区） 乡(镇，街道)
编号
患者姓名
性别
年龄
户主姓名
详细地址
电话号码
外出史及地点
职业
体温（oC)
发热
日期

初步
诊断
血检
日期
血检
结果
检查人

注：初诊诊断指病人被临床诊断为疟疾，疑似疟疾，感冒，不明原因发热或其它疾病。

附件5：
“三热”病人疟原虫血检统计表

省 市 县（区） 月份：
序号
血检单位名称
血检
人数
镜检结果
备注
阴性数
Pf例数
Pv例数
混合及其它
（Pm & Po）例数

合计

注：Pf＝恶性疟，Pv＝间日疟，Pm＝三日疟，Po＝卵形疟；混合感染在所有鉴定出虫种和混合栏内都打“V”。

填报人： 审核人： 填报单位： 填报日期：
附件6：
疟原虫血片镜检复核记录表

省 市 县（区） 乡(镇，街道)
序号
血片编号
血检结果
复核结果
评分
制作
染色
清洁度
总分

复检人： 复检日期：

附件7：
疟原虫血片镜检复核统计表

编号
被复核单位
近三个月血检人数
阳性片数
复核数
制作合格率（％）
染色合格率（％）
清洁度合格率（％）
阳性血片错检率（％）
阴性血片漏检率（％）

填报人： 审核人： 填报单位： 填报日期：

抄送：各市州疾病预防控制中心。
湖南省卫生厅办公室　　　　　　 　2011年7月28日印发
（共印40份）