非损伤微测技术简介.doc

1 诞生
非损伤微测技术（Non-invasive Micro-test Technique，NMT）起源于美国MBL。1990年MBL的科学家Kühtreiber和Jaffe使用非损伤微电极测量了进出细胞的Ca2+流速和运动方向，开创了生物活体静态测量到动态测量转变的先河。1995年MBL的科学家在《Nature》发表文章阐明了非损伤微测技术的数学、物理学基础以及应用方式，进一步完善了非损伤微测技术，从此非损伤微测技术进入各研究领域并发挥着越来越重要的作用。
2 原理
以Ca2+离子选择性微电极为例说明非损伤微测技术的工作原理。
Ca2+离子选择性微电极通过前端灌充液体离子交换剂（Liquid Ion Exchanger，LIX）实现选择性。该电极在待测离子浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量，获得电压V1和V2，两点间的浓度差dc通过V1和V2及已知的该电极的电压/浓度校正曲线计算获得，将它们带入Ficks第一扩散定律J0=-D·dc/dx（10-12mol/cm2·s）获得该离子的流速和运动方向。D是离子扩散常数。
注：荧光染料/光纤、纳米碳丝、金属/合金等材料均可作为选择或特异性的离子/分子电极。
3 经典应用
葡萄牙生物学家Feijó使用非损伤微测技术结合激光共聚焦显微镜研究了卵细胞和配子融合的过程。细胞融合一旦发生，就可以测得卵细胞外一个明显的Ca2+内流，同时测到卵细胞内Ca2+浓度显著增加，直接验证了胞内Ca2+的增加是由于吸收胞外的Ca2+而非内源的Ca2+释放所引起的这一科学问题。
4 技术特色
测量信息：离子/分子的电流、电压、绝对浓度、流速、三维运动方向
测量方式：非损伤性、活体、动态、实时、长时间、多维扫描与测量……
测量对象：Ca2+、H+、K+、Na+、NH4+、Mg2+、Cd2+、Cl-、NO3-、O2……
测量材料：整体→器官→组织→细胞层→单细胞→细胞器（富集）
5 涵盖技术
非损伤微测技术（Non-invasive Micro-test Technique，NMT）是一大类微电极技术的统称。
非损伤微测技术所涵盖的技术包括：
扫描离子选择性电极技术（Scanning Ion-selective Electrode Technique，SIET）
扫描振动电极技术（Scanning Vibrate Electrode Technique，SVET）
扫描极谱电极技术（Scanning Polarographic Electrode Technique，SPET）
自参比离子选择性电极技术（Self-reference Ion Selective Electrode Technique，SERIS ）
自参比极谱电极技术（Self-reference Polarographic Electrode Technique，SERP ）
自参比酶辅助电极技术（Self-reference Enzyme Assisted Electrode Technique，SERE）
扫描参比微电极技术（Scanning Reference Electrode Technique，SRET）
微电极离子流技术（Microelectrode Ion Flux Estimation Technique，MIFE）
其中SIET、SERIS、MIFE技术主要测量离子的浓度、流动速率、流动方向等信息。
SPET、SERP技术主要测量小分子的浓度、流动速率、流动方向等信息，SERP技术主要测量生物大分子的浓度、流动速率、流动方向等信息，SRET技术主要测量局部区域的电位分布和电压值变化，SVET技术主要测量局部区域的电流分布和变化情况。
这些技术的共同特点一是测量时微电极不接触被测样品，不会对样品造成任何损伤；二是空间分辨率高，可以实现微米级的测量；三是测量数据精度高，对离子分子流动速率的测量可达到10-12数量级，对电流的测量可达到pA量级。综合这些特点，故把这些技术统称为“非损伤微测技术”。
6 应用领域
非损伤微测技术已经应用于科学研究的许多领域，如生命科学、医学、药物学、药理学、环境科学、农业科学等诸多领域。
7 应用方向
Ca2+振荡 离子流研究
细胞活性与凋亡的评价 上皮及内皮细胞研究中的关键离子
代谢与内分泌中的离子变化 气体分子：NO、O2
肿瘤研究及其药物的评价 重要疾病的发生发展机制
感觉及神经系统中的关键离子流 胚胎发育的研究
生殖健康的应用 伤口愈合方面的应用
细胞极性生长 细胞的融合
机械损伤与生物损伤下的离子流研究 营养吸收与利用的研究
重金属毒理学研究 渗透调控的研究
……
二、测试常见问答（FAQ）
1 通过非损伤微测技术（NMT）可以获得什么信息？
非损伤微测技术（NMT）获得的是离子/分子的电流、电压、浓度、流速和运动方向的信息。
2 NMT为什么测定的是样品表面的离子/分子信息而不测样品内部的离子/分子信息？
由于微电极测量的特点，如测量样品内部，则会对样品产生破坏，因此无法达到非损伤地测量，使得测试数据不能反映样品的真实生理状态。随着荧光技术的发展，逐步成为测量样品内部离子/分子信息的主流方法，而NMT则专注于样品外微环境离子/分子信息的测量。
正因为荧光技术和非损伤微测技术有很大的互补性，美国扬格科技公司和旭月公司在2008年推出新产品——共聚焦/荧光非损伤微测系统（Conflux），结合两种技术的优势，实现了对样品离子/分子信息的内外兼测，其获取的数据有非常强的说服力。
3 测试中所用的测试液和校正液是什么？
测试液是指测试样品时样品所处的溶液环境。
校正液是指用来校正电极的溶液，原则上尽量和测试液相似，包含所测定的离子浓度，高浓度校正液和低浓度校正液应该包含所测定的离子浓度，高低校正液浓度一般相差10倍（一些分子除外）。
注意：测试液中的离子浓度是指溶液所有盐中同一种离子的浓度总和。
测试液pH的调节需注意，测定什么离子就不能用什么碱去调，如测定Na+ 时调节pH值不能有NaOH调节，否则就使溶液中的Na+含量增加，可用较少量的KOH调节，或者用氯化胆碱。
4 测试液和校正液配方的设计需要遵循哪些原则？
（1）测试液尽量和样品的培养液一致，使样品保持活体状态。
（2）测定的离子含量在测试液中不宜过高，尽量维持一个较低的水平。
（3）测试液中应该含有所测定的离子（特殊的研究，如先用没有所测定离子的溶液，然后再加入此种离子的实验情况除外）。
（4）测试液尽量维持一定的渗透压和pH值，以保证样品的活性。
（5）不同的校正液之间的浓度一般相差10倍（特殊的分子除外）。
5 测试中所用的溶液需要灭菌处理吗？
严格讲所有溶液均需灭菌，特别是当溶液中含有糖类等容易滋生细菌的物质时，不灭菌会对测试结果产生影响。但为了实验的方便，当溶液中仅含无机盐且被测样品对细菌不是非常敏感时，可不做灭菌处理。
6 为何测试液和校正液需要客户自己配制？公司可以储备一些标准测试液和校正液吗？
为保证测试数据的最佳质量，被测样品要处于最佳活性状态。测试样品尤其是生物样品的活性受多种因素的影响，其所处环境是最重要影响因素之一。客户的样品已经适应了客户的试剂环境，在该试剂环境中容易达到最佳活性状态。如果更换试剂环境，可能引入一些不可预测和不可控制的因素，使样品不在最佳活性状态，不利于产出最佳数据。所以测试液应由客户自行配制。为保证校正的准确性，校正液和测试液的试剂环境应当一致，所以校正液也请客户自行配制。
另外，对于不同测试样品，测试液的成分差别很大，具有很强的个体性，不存在适用于多种样品的所谓标准测试液。校正液同样也很难做到通用。为达到最佳测试效果，一般应使用新鲜溶液，不建议使用长期储存的溶液。
7 样品如何准备？
尽量使所测定样品的部位保持完好无损，使样品保持正常的生理状态，简单地说，就是使所测定的样品好好地活着。
测定时，把所要测定的部位进行固定，例如细胞贴壁，或者用多聚赖氨酸把悬浮细胞固定在培养皿底部。较大一点的组织，如植物的根，用滤纸条和小石块轻轻压住，使样品基本保持一个较为静止不动的状态。
8 实验中典型的数据是什么样子？它们的含义是什么？
如下图所示，通过NMT同时测定拟南芥根中Ca2+和H+的流速。

如上图，红色的线代表H+，绿色的线代表Ca2+，所记得数据为距样品不同两点间的电压差ΔuV（纵坐标），横坐标为记录的时间，在零线上面的曲线是指离子外流（Eflux），零线下面的曲线是指离子内流（Influx），白色的一个点是指进行了一个刺激处理，当受到刺激处理后，H+和Ca2+的内流增加。根据电压差可以换算成流速，电压差和流速的趋势完全一致。
9 如果数据不够理想，一般是什么原因造成的？如何发现问题出在哪里？
数据不够理想的最可能原因是被测样品的活性状态不佳，其次是配制的测试液存在问题。当然也可能是测试系统本身存在故障，但这种可能性很小，而且很容易及时发现和纠正。
例如，为确认测试中问题产生的原因，可进行人工离子源实验。首先在去离子水中进行人工离子源实验，若能观察到正常浓度梯度反应曲线则基本可以排除系统故障的可能性。其次在测试液中进行人工离子源实验，若能观察到正常浓度梯度反应曲线则基本可以排除测试液存在问题的可能性。
注意：样品间某些离子可能存在个体间的差异，因此测试时会出现重复性不好的情况，这种情况需要从样品本身入手寻求解决的办法。
10 测试所获得的数据如何分析？
原始数据已经有专门的分析软件——Mageflux。该软件完全免费，使用也很方便。公司向客户提供Mageflux的使用说明，为客户开通专用账户。