细胞凋亡.doc

　　　　生存和死亡是存在于所有生物的一对矛盾，它们维持着生物界的平衡，机体的免疫系统亦不例外，免疫细胞的增殖和死亡是免疫系统得以保持自身平衡的重要条件。

　　细胞的死亡是人们很早就注意到的现象。1972年Kerr首先提出了有别于一般死亡意义的一种新的概念，称之为凋亡（apoptosis）。对凋亡的研究近年来进展很快，引起了多学科的广泛重视，为肿瘤和自身免疫性疾病的防治等研究方面提供了新的思路。

　　一、凋亡的生物学特征

　　（一）凋亡的概念

　　细胞的死亡有两种方式，第一种是细胞在受到严重的操作后发和的死亡，通常表现为细胞的突然死亡。在死亡过程的最早期，线粒体的功能和形态即发生变人经，继之，细胞失去自身平衡，细胞膜的操作导致渗透压平衡的失调，细胞出现肿胀，最后胞膜破裂，胞浆内容物外泄，引起组织器官的炎症反应，这种方式被称为坏死（necrosis）。

　　另一种细胞死亡的方式是1972年Kerr等在正常的生理状态下观察到的，这处死亡方式最初被描述为一种正常生理状态下的形态学改变。8年以后，这个实验小组将这种形式的细胞死亡命名为凋亡，以区别于坏死。凋亡是机体的正常细胞在受到生理性和病理性刺激后启动的自发的死亡过程，是一种主动的、信号依赖的过程，包括胞浆内Ca2+、cAMP升高，RNA和蛋白质合成增加。其典型的特征是一种内源性核酸内切酶的激活和由此导致的细胞染色体DNA的降解，DNA在核小体外被切断，形成约185bp或整数倍长度的DNA片段，DNA电泳时形成特征性的梯形（ladder）电流条带。这种细胞死亡方式的另一个特点是，降解的胞浆及胞核成份被包裹于膜性成分中而形成凋亡小体（apoptosis bodies），胞膜成份和结构的改变可以被吞噬细胞表面的粘附分子及磷脂酰丝氨酸受体（phosphatidylserine receptor）快速识别，凋亡细胞被吞噬并降解，因此不引起局部的炎症反应。

　　（二）凋亡与坏死、程序化细胞死亡

　　坏死是由于补体或裂解性病毒等致细胞裂解因素造成的细胞胞膜的直接损伤，或是由于其它因素干扰胞膜上的能量依赖泵的功能而造成细胞水分、离子浓度的失衡，导致细胞膜破裂，胞浆内容物外泄，进而引起炎症，是一种病理状态下的细胞死亡。

　　在描述细胞死亡的术语中，还有一个概念是程序化细胞死亡（programmed cell death,PCD）。PCD最初是发育学的一个术语，是指机体发育过程中出现的一系列与发育相关的细胞生理性死亡过程。后来，这个概念被用来指由基因介导的细胞死亡，例如放射性照射的未成熟T细胞经历的死亡过程。启动PCD的因素通常为正常的生理信号，其发生需要有某些基因的表达，给将发生PCD的细胞加入RNA或蛋白质合成抑制剂，不但不会促进PCD的发生，反而延迟或阻止PCD的发生。医学全.在线.网.站.提供

　　凋亡和程序化细胞死亡并不是完全相同的，大部份的PCD过程伴有凋亡的形态学改变。但某些物种组织细胞在发育过程中经历的PCD并没有凋亡典型的胞膜出泡、染色质局限化和DNA降解。本文中，我们把凋亡和程序化细胞死亡当成是一种通用的概念。

　　（三）与凋亡相关的基因

　　所有的PCD过程都有新基因的表达和蛋白质的合成，在绝大多数凋亡也是如此。PCD所需的蛋白在正常的细胞中是非组成性表达的，即这些基因的表达是诱导性的。已报道有大量的基因可能与PCD的发生有关，它们促进或抑制PCD的发生，如c-fos、c-myc、TGF-β、p53、bcl-2、apt-4、apt-5、nuc-1、ces-2、ced-3、egl-1等。到目前为止，这些基因中只有小部分被确定为PCD所必需，如p53和cel-1等。到目前为止，这些基因中只有小部分被确定为PCD所必需，如p53和c-myc的表达可以诱导某些T细胞和白血病细胞发生PCD，将p53基因转入白血病细胞中即可迅速引起PCD。bcl-2是抵抗PCD的基因，bcl-2基因的缺失突变将促进PCD的发生。目前，这些基因影响PCD的机制还不十分清楚。

　　二、免疫细胞中的凋亡

　　各种免疫细胞都存在有凋亡的现象，这对保持免疫系统的平衡十分重要。诱导免疫系统PCD的因素有生理性和非生理性的。生理性因素如细胞因子浓度的改变、B细胞发育过程中Ig基因的重排等。非生理地因素如电离辐射、加热、药物等。体外培养的淋巴细胞对电离辐射尤为敏感，即使暴露在2-5Rad下也能产生形态改变，X身线和Y射线可诱导静止期的淋巴细胞出现典型的凋亡改变，这一过程有赖于大分子的合成。加热对于胸腺细胞来说是一种PCD凋亡特征的DNA降解。其它因素如甲醇、DMSO等在低浓度条件下可诱导PCD，浓度过高时则引起细胞的坏死。

　　（一）干细胞

　　干细胞在骨髓的造血环境中受到基质细胞、细胞外基质、生长因子和抑制因子的作用。这些因素共同作用，控制造血干细胞的自我更新和分化。细胞因子在造血干细胞的凋亡过程中发挥重要的作用，IL-3、GM-CSF、IL-6等不仅对于造血干细胞的增殖分化是必须的，而且对保持干细胞的存活也是必不可少的。去除这引起细胞因子将是致干细胞发生凋亡。因此，有的学者提出了一类新的造血因子概念，即造血挽救因子（survival factors），这类因子的存在可以阻断细胞凋亡的机制，通过其尝试的变化影响凋亡，达到地造血干细胞调节的作用。EPO、IL-3、GM-CSF、G-CSF等对造血干细胞凋亡均有抑制作用。目前认为EPO对凋亡的抑制机理是，红系干细胞发育从CFU-E或更早的BFU-E开始进入对EPO的依赖阶段，在这一时期，如果失去EPO的维持，红系干细胞将发生凋亡，EPO的作用只是抑制干细胞发生凋亡，但对细胞的DNA合成并汉骨促进作用。CFU-E中的红系干细胞在无EPO存在的条件下培养16小时，70%的DNA被降解，在EPOSCF存在的条件下，DNA的降解比率分别为3%和42%。

　　1.胸腺细胞的发凋亡　淋巴干细胞通过血流进入胸腺，在胸腺中的发育成熟过程中要发生基因的重排和分化，同时，胸腺细胞要经历严格的选择过程，只有那些对自身MHC分子亲和力较高的细胞克隆才被允许发育为CD4+和CD8+双阳性细胞（阳性选择）。其中那些对自身抗原和力较高的胸腺细胞必须清除（阴性选择）。胸腺细胞在胸腺中的阳性选择和阴性选择是通过凋亡机制来实现的，其机制与胸腺细胞和胸腺基质细胞间的相互作用有关。大部分的胸腺细胞是未经阳性选择或阴性选择过的，因此其平均寿命很短，只有3-4天，代表了胸腺中凋亡的整体水平。在胸腺细胞中，凋亡与内源性糖皮质激素有关，未成熟胸腺细胞对糖皮质激素是敏感的，而成熟T细胞对糖皮质激素则是抵抗的。

　　2.活化T细胞与凋亡　静止T细胞受到丝裂原CD3-TCR抗体的诱导而发生增殖，产生细胞因子。同样的信号在未成熟T细胞和T细胞杂交瘤则诱导细胞的凋亡，这种凋亡也称为活化诱导的细胞死亡（activation-induced cell death, AICD）。决定这种差别的因素目前还不完全清楚，可能与Ca2+流量和蛋白激酶C（PKC）有关。蛋白激酶C可以阻断引起核酸内切酶海参性所需的Ca2+流，它可能通过抗原刺激依赖的第二因子（如IL-1激活的蛋白激酶C）的存在与否来诱导凋亡或增殖。

　　活化诱导的细胞死亡并不仅仅限于未成熟的胸腺细胞和T细胞杂交瘤，在成熟的外周T细胞也发现了类似的情况。表达TCRαβ或TCRγδ的小鼠和人T细胞在受到抗CD3-TCR抗体、PHA或抗Fas单抗的诱导时发生凋亡。

　　（1）活化状态的外周T细胞更易发生凋亡：经丝裂原活化和体外扩增培养的人外周T细胞对凋亡更为敏感。小鼠脾脏T细胞在对凋亡易感之前也需要受到抗原的激活。在活化的T细胞中，对凋亡的敏感性在CD4+和CD8+T细胞亚群之间无差异，在小鼠CD4+细胞中，Th1和Th2亚群之间亦无明显的区别。

　　（2）细胞因子在凋亡中的作用：目前关于细胞因子在体外诱导和阻止凋亡中发挥作用的报道不尽一致。在辅助性T细胞亚群和细胞毒T细胞亚群中，不仅其激活和增殖需要依赖IL-2，其存活也需要IL-2的支持。如在上述细胞的培养基中支除IL-2可使细胞在6小时内进入PCD。在体内，这种对细胞因子的信赖性与机体在抗原清除后扩增的效应淋巴细胞亚群的消失有关。以防止过高和维持时间过长的免疫应答。

　　（3）抗原诱导的T细胞的凋亡：抗CD3单克隆抗体及PHA虽然能有效地诱导外周T细胞的活化，但它们不是生理性的刺激剂。目前认为AICD也能以抗原特异性的方式发生于T细胞，如超抗原葡萄球菌肠毒素（SF）能在体外及体内诱导活化T细胞的凋亡。抗原诱导的T细胞的凋亡也发生于同种异体抗原的刺激，当同时异体抗原再次刺激机体时，有20%-30%的同种异体反应细胞发生了AICD。

　　（4）AICD的调节及其意义：相同的抗原在通过CD3-TCR刺激静止T细胞活化的同时，也启动了活化T细胞的凋亡过程。那么，静止细胞和活化细胞发生凋亡是如何调节的呢？一种可能的机制是某一特定的T细胞克隆的活化和凋亡是同时进行的，抗原的量决定增殖抑或凋亡。SE超抗原在诱导部分活化细胞（40%-50%）凋亡的同时，也有MHCⅡ抗原阳性的抗原提呈细胞的作用下诱导其余T细胞（50%-60%）的增殖。AICD是外周T细胞克隆清除（clonal deletion）的一种机制，有助于机体免疫耐受机制的建立，也是对细胞免疫调节的补充。当抗原活化的T细胞与特异性抗原接触时诱导部分T细胞发生AICD，使得机体能在一定范围内限制免疫应答的强度。

（三）B细胞

　　B细胞根据其分化的不同阶段对抗原的刺激有不同的反应。前B细胞在发育过程中必须经历免疫球蛋白的基因重排。基因重排未成功的B细胞将发生凋亡，重排成功的前B细胞最先表达膜表面IgM，如果前B细胞在这个阶段接触抗原，它们将会夭折，这是机体去除自身抗原反应细胞的一种机制。因为大多数出现在骨髓的抗原是自身抗原。mIgM、mIgD阳性B细胞如无抗原刺激一般于24小时之内在脾脏中死亡，脾脏B细胞胞核有高浓度的Ca2+、Mg2+，可诱导内源性的核酸内切酶，与无抗原刺激B细胞的凋亡有关。B细胞mIg结合相应抗原的亲和力成熟在保持B细胞的存活中起重要作用，只有对抗原刺激能产生高亲和力抗体的B细胞才能逃避凋亡。

　　（四）髓样细胞

　　免疫系统其它细胞中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞都与炎症发生密切相关。体外实验表明，它们各自在炎症中的作用可通过细胞因子对凋亡的发生来加以调节。髓样细胞系HL-60细胞在培养时，除小部分细胞自发分化外，大部分细胞在经历5-7天的培养时间后发生凋亡。单核细胞在失去某些刺激时将发生PCD，FMLP、C5a、MCP-1、TGF-β、IL-2、IL-4和IL-6都不能阻止单核细胞的凋亡，而适当浓度的IL-1β、TNF-α、TIFN-γ和GM-CSF等炎症因子则能阻断单核细胞PCD过程。活化的单核细胞也通过自分泌方式产生IL-1β、TNF-α和GM-SCF。有趣的是，TNF-α在成熟单核细胞和单核细胞系U937中对PCD的诱导作用是完全相反的。新鲜分离的嗜酸性粒细胞在体外培养72-96小时后即进入PCD，而具有促进嗜酸性粒细胞集落形成作用的IL-5能使嗜酶性粒细胞的PCD过程推迟80小时。LPS、C5a和FMLP在体外能以剂量依赖式推迟中性粒细胞的PCD过程。炎症因子对嗜酸性粒细胞和中性粒细胞PCD的推迟，有助于死亡的细胞被巨噬细胞完整地摄入并加以清除。

细胞凋亡与免疫

细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜包小泡的一种精确调节的细胞死亡过程，是目前生物界最热门的话题之一。细胞凋亡之所以引起学者们的广泛关注，在于它在保证许多生物的健康生存上起到了十分关键的作用。它在生物的发育过程中塑造了神经系统，并且保证了免疫系统行使正常功能。细胞凋亡是免疫应答和免疫调控的重要形式之一，免疫细胞的增殖与分化过程是与免疫细胞的正常死亡相统一的，免疫应答的效应过程也是与靶细胞的死亡相伴随的。细胞凋亡的研究也是免疫学的重要课题。

1.概念

1972年，Kerr首先提出细胞凋亡是不同于坏死的一个主动的自我破坏过程。1980年，Wyllie等在糖皮质激素诱导胸腺T细胞死亡的过程中，观察到一系列形态学和生物化学的变化，与常规坏死不同，认为这是细胞内基因调控发生的有序的死亡过程，并提出了细胞程序性死亡（PCD）的概念。作为生命过程中同一个过程的两个方面，凋亡和增生同样不可缺少，二者是辨证统一的。对免疫学来说，细胞凋亡有特殊的意义。免疫系统识别外来异物和自身组织的形成，必须依靠对自身起反应的淋巴细胞的删除，而这种删除主要是通过细胞凋亡来完成的。淋巴细胞对靶细胞的杀伤过程部分也是通过靶细胞凋亡来实现的。细胞凋亡如果出现紊乱，机体可能出现严重的病理状态，如肿瘤、白血病、自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等）、免疫缺陷等。以下对细胞凋亡的基本机制、信号传导、分子事件及疾病治疗等方面的研究成果综述如下。

（1）基本机制
多细胞动物体内的细胞具有一套相似的酶系统，激活后可以启动细胞凋亡。线虫Caenorhabditis elegans是研究细胞死亡机制的一种很好的生物模型。C.elegans的三种基因产物：CED-3，CED-4和CED-9对凋亡而言是十分重要的，CED-3和CED-4促使凋亡，CED-9抑制凋亡。CED-3是一种caspase,即一种半胱氨酸蛋白酶，它在天门冬氨酸存在的部位之后切断蛋白。CED-3是一种酶原，通过自身切割而活化。CED-4与CED-3结合并激活CED-3，CED-9与CED-4结合从而阻断CED-4激活CED-3。通常，CED-9与CED-4和CED-3形成复合物是CED-3保持无活性状态。当引起细胞凋亡的刺激发生时，CED-9会分解从而活化CED-3，继而导致细胞死亡。脊椎动物已进化出一整套基因族，类似于C.elegans的死亡基因。哺乳动物的caspase类似于CED-3。Apaf-1是目前唯一已知的哺乳动物体内CED-4类似物。哺乳动物Bcl-2基因族产物与CED-9有关，但包括两个蛋白亚群，一个亚群抑制凋亡，一个亚群促进凋亡。

（2）死亡受体直接介导凋亡机制
从细胞生存环境发出的生存信号和内部感受器对细胞完整性的感知使细胞的凋亡机制随时处于戒备状态。一旦细胞失去与外界的联系或内部发生难以修复的损伤则启动凋亡。细胞同时受到加快分裂周期和减慢分裂周期的信号时，也会促发凋亡。哺乳动物已经进化出一套机制使生物体能自主性的指导其个体细胞自我毁灭。这类有益的凋亡对免疫系统尤为重要。死亡受体——细胞表面传导由特定“死亡配体”引起的凋亡信号的受体——在这类凋亡中发挥了核心作用。这些受体可以在与配体结合的数秒内激活死亡caspase，并在数小时内引起细胞凋亡。

3. 细胞凋亡的信号传导途径
近年的工作表明，在不同的系统中，许多信号传导调节了细胞的死亡过程，他们包括:
细胞浆中的Ca2+浓度上升、cAMP累积、蛋白酶C的激活、酪氨酸蛋白激酶的活化和神经酰氨的产生。这些充分说明，细胞凋亡是一个调节性很强的过程，象细胞的增殖和分化一样，它也是由激素和受体介导的。

Ca2+的调节或流人（influx）激活了细胞内的核酸内切酶，在胸腺和免疫细胞中引起细胞凋亡。有实验表明Ca2+浓度的高低调节了细胞凋亡。胞外或胞内Ca2+螯合剂、通道阻塞剂和钙调蛋白拮抗剂能够延迟或阻止细胞凋亡。

刺激腺苷酸环化酶或引起cAMP上升的试剂使胸腺细胞和淋巴细胞凋亡。关于依赖cAMP的蛋白激酶和磷酸酶的影响还不很清楚，转录因子能够介导cAMP的效应；cAMP通过磷酸化抑制成纤维细胞的Ras通路。

生理活性因子能抑制细胞凋亡，都是通过酪氨酸蛋白激酶活性（PTKs）的受体来介导的。和其它的一些信号分子一样，PTKs调节凋亡过程也有两面性，B细胞的凋亡可以是由电离辐射刺激的PTK活性所引起。T细胞表面抗原CD4或CD8所启动的T细胞受体介导的凋亡过程也是由同一机制所引起。

神经酰氨（ceramide）是一种新型的第二信使。它激活胞质内的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（CAPP），CAPP参与了对凋亡的调节。

信号传导十分复杂，增殖、分化和凋亡是一个紧密连接的整体，有时是同一分子机制在起作用。可以认为细胞凋亡是由不均衡的信号传导引起的。

4. 细胞凋亡与疾病治疗

细胞的稳态平衡，是细胞生与死的总体平衡。一旦失衡则造成细胞的堆积或丢失，细胞凋亡受阻或增加，都有可能导致疾病。

(1) 与凋亡受阻相关的紊乱、的紊乱

与凋亡受阻相关的紊乱可导致包括肿瘤、自身免疫缺陷性疾病如系统性红斑狼疮，以及病毒感染性疾病如腺病毒的感染。与细胞过量死亡相关的紊乱可导致病毒诱发的淋巴死亡如AIDS。还可导致神经变性紊乱因而导致一些神经性疾病如肌萎缩性侧索硬化病以及一些由血细胞紊乱导致的疾病。

(2) 细胞死亡的调节——治疗前景

既然这些疾病是由于凋亡失控的结果，要治疗这些疾病就必须把它们反调过来使之成为正常的状态，即反其道而行之。

对第一类疾病（与凋亡受阻相关），有如下治疗措施：（1）诱发细胞凋亡的试剂：化学治疗试剂，放射线。（2）生长因子、细胞因子、视黄酸等。（3）Bcl-2 mRNA的反义寡核苷酸可以抑制Bcl-2的表达。（4）小分子药物试剂参与蛋白—蛋白和蛋白—核酸的相互作用，从而调节Bcl-2基因的表达。（5）自体免疫疾病可用与疾病有关的自体抗原来治疗。

对第二类疾病（与细胞过量死亡相关）可有如下治疗措施：（1）增加Bcl-2的表达量。（2）对局部贫血，可用调节钙代谢的试剂。（3）调节刺激信号，抑制细胞表面与凋亡有关的效应器。（4）半胱氨酸蛋白酶抑制剂的加入。

5. 总结

毫无疑问，细胞凋亡是当前生命科学的研究热点，其中以凋亡机制的研究最为重要。它可以使我们深入了解凋亡的发生、发展过程，以及凋亡与维持机体正常生理功能之间的关系。细胞凋亡的研究的深入，不仅可以进一步阐明凋亡的作用机理，而且有望对免疫缺陷性疾病以及其它一些恶性疾病的治疗提供理想的途径，具有重要的理论和实践意义。

细胞凋亡与自身免疫性疾病

1．1. 细胞凋亡
1．1细胞凋亡概念

对机体组织而言，细胞分化是一个连续不断的过程，以维持器官大小和功能的稳定，防止肿瘤的发生，这种平衡是通过分化率和死亡率(即细胞凋亡)的协调得以实现。细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed
cell
death，PCD)，又被简称为凋亡，其确切含义是：机体在生长、发育及维持内环境稳定过程中，由基因控制的自主的有序性细胞死亡行为。细胞凋亡作为一种基本的生命现象。普遍存在于各种组织及机体发育的各个阶段，在维持正常组织的稳态平衡方面起着重要的作用。与细胞的坏死不同，细胞凋亡不是一种被动的过程，而是一种主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。它并不是病理条件下的自体损伤，而是更好地适应生存环境主动采取的一种死亡方式。

虽然细胞凋亡与细胞坏死的最终结果极为相似，都是结束细胞生命，但它们的过程与表现却有本质差别。“坏死”是细胞受到强烈物理、化学或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，核变化较慢，DNA降解不充分，可引起局部严重的炎症反应；
“凋亡”是细胞对环境的生理性或病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答，是有序变化的死亡过程。

一般认为凋亡本身不会引起炎症和周围组织损伤，是一种“清洁”的死亡方式。因为理论上细胞凋亡时，细胞膜始终保持完整，胞内内容物无溢出，故不会引起局部的炎症反应，这与坏死的细胞肿胀、破裂、溶酶外溢而引起的炎症过程完全不同。但是，凋亡与炎症之间仍然具有一定的相关性：当环境不利于吞噬细胞摄取凋亡细胞时，或者凋亡大量发生使吞噬不能及时完成时，凋亡细胞仍将发生裂解，从而导致非特异性的炎症前介质的释放，促成炎症反应。而炎症的消退有赖于局部堆积的炎性细胞经凋亡被清除，一旦这种机制失效时就表现为炎症的持续存在。
1．2细胞凋亡的形态学与生化特征

细胞凋亡具有其特异性的形态学改变。实体细胞凋亡时，其表面微绒毛消失，与周围细胞脱接触。接着，凋亡细胞胞浆开始脱水产生空泡，并与胞膜融合，出现胞膜空泡化；此时细胞因水份丧失出现细胞固缩、核固缩和发芽；之后细胞膜内陷，将细胞分隔成多个有外膜包裹、表面光滑的内涵物不外溢的凋亡小体(apoptosis
bodies)，其中可含有各种不同的、结构尚完整的细胞器，以及染色质的短片等；凋亡小体的大小相差很大，其数目则与原细胞的大小直接有关。在凋亡的整个过程中，没有细胞的内容物的外漏，因此也不伴有局部的炎症反应。
细胞在凋亡过程中发生着复杂的生化变化，目前尚没有完全搞清楚凋亡的整个生化机制。已有的研究结果表明，细胞凋亡的主要生化特征包括如下：①
DNA的片段化：由于胞内Ca2+．依赖性的内源性核酸内切酶激活，基因组的DNA在核小体连接区发生非随机性降解，产生大小不等的寡核小体片段，其大小相当于核小体(180～200bp)的倍数，在琼脂糖凝胶电泳中可见特征性的“梯”状DNA条带．而细胞坏死时DNA随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶电泳呈弥散状。出现特征性的DNA阶梯(DNAladder)是细胞凋亡在生物化学方面的典型变化。②钙超载：在80年代人们发现用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时发现凋亡的细胞内游离Ca2+浓度显著上升．用Ca2+载体A23187，人为提高B淋巴细胞内Ca2+的水平，可诱导B淋巴细胞的凋亡。而用钙络合剂降低细胞内水平，能阻止凋亡发生。后发现凋亡细胞存在钙超载现象．Ca2+在细胞凋亡中充当凋亡信号传递的角色。③内源性核酸内切酶激活：在凋亡时，细胞核内的核酸内切酶常常被激活，从无活性状态变成有活性，多数核酸内切酶是一种二价金属离子依赖性酶，Ca2+／Mg2+增加酶的活性，而Zn2+能抑制它的活性。当然在某些细胞内也存在非二价金属离子依赖性核酸内切酶。Zn2+也不能抑制其活性。
1．3细胞凋亡的信号转导途径

细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维持内环境稳定，受遗传控制的细胞主动死亡程序。细胞凋亡程序是在一定的诱导条刊：下发生的，例如正常或病理性刺激，多种疾病包括自身免疫性疾病，肿瘤，免疫缺陷和神经退化性疾病。细胞凋亡最终将激活细胞内以无活性原酶形式存在的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族，即caspase家族。该家族成员均具有一保守的五肽活性位点，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用切断该位点后形成活性酶。活化的caspase激活其下游caspase家族成员及其他蛋白酶引起级联反应并最终导致细胞溶解。不同种类的细胞在接受不同的细胞外刺激后引起凋亡的形态学改变是高度保守的，但是它们并不是遵循同一种固定的或有规律的模式进行，而是通过各自的信号转导途径来传递胞膜上的死亡。哺乳动物细胞凋亡由两条信号转导途径调控，在某些种类的细胞中这两条信号转导通路可能相互关联。
1．3．1死亡受体途径

又称为外源性凋亡途径，是通过激活细胞膜上死亡受体而触发细胞凋亡机制。死亡受体属于TNFR基因超家族成员，可传导由特定的死亡配体引起的凋亡信号。目前发现的死亡受体包括：CD95(Fas从PO-1)、TNFRl(p55或CDl20a)、DR3(Death
Receptor 3)、DR4和DR5等，
因此有分别由CD95，TN"FRI，DR3，DR4和DR5介导的信号传导途径。其中最典型且研究最多的死亡受体为CD95(Fas／APO-1)。CD95(Fas／APO-1)广泛分布于各种有核细胞，FasL属I型跨膜糖蛋白，位于活化的T淋巴细胞表面，由胞外区(157个aa)、跨膜区(17个aa)、胞内区(145个aa)三部分组成。Fas胞内区C端一段60-70氨基酸序列与TNFR胞内区同源，并介导细胞死亡，称之为死亡域(Death
domain，DD)，对于Fas传递凋亡信号进入细胞内非常重要。FasL是Fas的配体，以膜结合蛋白P40和可溶性蛋白P27形式存在。含死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)是存在于胞浆中的一种蛋白质，靶细胞表面Fas与FasL结合后，诱导Fas分子的三聚体化，继而Fas分子胞浆段内的DD与FADD梭基端的DD结合，促使FADD
N端的死亡效应区(death effector
domain，DED与pro—caspase-8(或10)中的DED结合，形成由Fas／FADD／pro-caspase-8(或pro-caspase—10)组成的死亡诱导信号复合物。pro-caspase-8(或pro-caspase-10)自身催化形成活化的异四聚体形式，从而激活下游的caspases，在通过一系caspase的级联激活反应发挥凋亡效应，最终导致细胞死亡(见图1)。

1．3．2线粒体依赖性途径

又称为外源性凋亡途径，在该途径线粒体外膜通透性改变促使细胞色素C释放是导致细胞凋亡的关键。以往的研究认为，细胞色素C等凋亡前体物质是通过线粒体膜上的膜通透性孔道(permeability
transition pore，PT孔) 释放到胞浆中的。
PT孔是位于线粒体内外膜之间的由不同蛋白组成的复合体，该复合体由胞质中的己糖激酶、线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道(VDAC)、线粒体膜间隙的肌酸激酶、线粒体内膜上的腺昔酸转运蛋白(ANT)以及基质中的亲环蛋白D(cyclophilinn
D)组成。PT孔是线粒体内外信息交流的枢纽，外界凋亡刺激因素可导致PT孔的开放，从而直接导致线粒体电化学梯度耗散、细胞色素C等凋亡相关分子的释放。PT孔开放导致线粒体内室的扩张，从而引起线粒体外膜破裂，进而导致膜间隙凋亡诱导因子的释放．线粒体的凋亡因素主要有细胞色素C和凋亡诱导因子(AIF)，细胞色素C进入胞浆后首先与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)的C末端结合，Apaf-1的N末端含有募集区，在ATP或者dATP存在下，细胞色素C-Apaf-1复合物募集并激活caspase-9，被激活的caspase-9切割效应caspases，如caspase-3和caspase—7，而启动凋亡通路。(见图2)
线粒体外膜通透性受到Bcl-2蛋白家族的调控。Bcl—2是B细胞淋巴瘤／白血病—2(B-cell
lymph-oma／leukemian-2)的缩写，Bcl—2基因家族是研究最早的与凋亡有关的基因，也是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。Bcl—2属于一类新的癌基因家族，其结构主要由两大结构域构成，即位于羧基端的跨膜结构域和数量不等的(1-4个)Bcl—2同源结构域(Bcl—2homology，BH)。其家族成员根据其所具有的BH结构域以及在细胞凋亡中发挥的生物学效应的不同大致将其分为三大类(具体成员及对细胞的作用见表1)：包括抑凋亡基因(Bcl—2和Bcl—x)，促凋亡基因(Bax和Bak)和只具有BH3结构域的基因(Bid和Bik)。

Bcl-2为Bcl-2家族的抗捆亡基因，其基因产物分子量为26KD。Bcl—2蛋白可表达于正常细胞的激活和发育过程中，在成熟组织中亦有表达，在走向凋亡的细胞中低表达或不表达。电镜下可见bcl—2蛋白位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上。1988年Vaux等首次正实Bcl—2基因高表达可以引发肿瘤，并且发现它可明显延长细胞的生长期，而对细胞的增值率没有明显影响。后来又有人发现Bcl—2基因及其蛋白可抑制多种组织的细胞凋亡，从而使人们认识到Bcl—2基因是一种新的癌基因，它不影响细胞的增殖，而是作为细胞凋亡的一个潜在抑制

子调节细胞死亡。人们通过Bcl-2脂质体转染细胞，Bcl-2反义寡核昔酸处理细胞等方法证实Bcl—2基因过高表达能明显延长细胞寿命，减少细胞凋亡，并对诱导凋亡因素如放射线、化疗药物、自由基等有明显抵抗作用。Bcl-2转染小鼠出现B细胞囊性增生并最终导致B淋巴细胞瘤。对Bcl—2基因抑制凋亡的机制还不十分明确，多认为是多因素共同作用的结果。有的学者认为Bcl—2基因可能是通过阻止细胞凋亡的早期环节发挥作用的，可阻止或降低细胞皱缩，染色质浓缩和DNA裂解的发生；还有人认为Bcl-2基因并不能降低药物诱导的DNA损伤，但可加速DNA修复，因此，Bcl—2基因可能通过阻止受损细胞DNA转录出对促细胞凋亡相关基因有激活作用的信号或者阻止这些相关基因产物的作用而抑制细胞凋亡。

Bax为bcl—2家族的促凋亡基因，其基因产物分子量为21KD，由192个氨基酸组成，其中21％的氨基酸与bcl—2同源。Bax蛋白由9条α螺旋组成，包含bcl—2家族结构特征的BHl，BH2和BH3及C末端的跨膜结构域，其BH3结构域位于α
2螺旋，对其与其他凋亡相关蛋白形成异二聚体以及线粒体膜定位都起着关键作用。在生理状态下，其C末端的α
9螺旋占据了BH3结构域所在的疏水口袋的结合位点，从而使其无法与其他bcl—2家族蛋白结合，也无法锚着在线粒体外膜上。当细胞接受到凋亡信号后，Bax
C末端α9螺旋与BH3结构域所在的疏水口袋的解离对于Bax的膜定位或同源(异源)二聚体的形成是必不可少的，BaxC末端α9螺旋与BH3结构域的结合很可能是Bax自身抑制的重要机制，用以防止在生理状态下BaxBH3结构域的暴露和线粒体膜转位所引起的细胞损伤。Bax与Bcl-2及Bcl—xL的抗凋亡区结合拮抗其保护性效应而促进细胞凋亡．Bax与Bcl—2的蛋白水平与凋亡调控直接相关，其比率影响细胞凋亡的倾向：Bax增高，促进细胞凋亡；Bcl—2增高，抑制细胞凋亡。Bcl-2的磷酸化可阻止它与Bax形成二聚体，使细胞趋于凋亡。

研究发现，Bcl—2家族蛋白对于线粒体盯孔的开放和关闭起着关键的调节作用，促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放，而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、Bcl-xl等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合，或者直接阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。
2．淋巴细胞凋亡

随着研究手段的完善和对细胞动物的生理作用的认识，现已证实淋巴细胞凋亡在免疫系统的发育以及免疫反应过程中起着决定性的作用。研究发现，在免疫系统中，凋亡与淋巴细胞的发生、选择、功能发挥和及时终止密切相关，调节着体内免疫细胞群的合适比例并参与了淋巴器官中免疫细胞的成熟和淋巴细胞抗原受体谱的发育，赋予机体具有分辨自身和非自身的能力，同时还决定着免疫耐受和免疫记忆的产生。
2．1淋巴细胞凋亡的调控

Fas／FasL系统：lpr和gld鼠分别发生了Fas基因和FasL基因的突变，致使不能消除T细胞而积聚在淋巴结和脾，产生淋巴结病和脾肿大，甚至发生自身免疫性疾病。敲除Fas基因的小鼠也有上述表现，且程度较1pr突变小鼠为重，通过转基因处理使1pr小鼠淋巴细胞表达Fas后，其淋巴增生现象得以缓解，充分证明Fas在T淋巴细胞的程序性死亡中起有的作用。Fas缺陷的鼠除T细胞异常，还发生B细胞的积聚和各种免疫球蛋白水平的提高，包括抗ssDNA抗体及抗dsDNA抗体。抗原快速免疫鼠后可以诱导生发中心中Fas的表达，而且通过C040激活的幼稚B细胞对Fas介导的凋亡敏感，而用CD40和18受体共刺激后产生抵抗，说明表达Fas的激活B细胞可能通过表达FasL的T细胞得以清除。

Bcl—2家族：Bcl家族所参与的细胞凋亡在抑制淋巴细胞的寿命和维持体内平衡方面有非常重要的作用。敲除基因Bcl-2或Bcl-XL后，淋巴细胞的存活受到严重影响，Bcl—2的缺失使得成熟淋巴细胞不能存活，而Bcl-XL的缺失导致不成熟淋巴细胞的死亡。结果显示Bcl—2及Bcl—XL对于淋巴细胞的发育成熟阶段非常重要。有研究证实Bcl—2家族蛋白在B淋巴细胞凋亡的信号传递通路中起着重要作用，同时发现在B淋巴细胞发育过程中，Bcl-2的转录调控具有时相特异性，在前B细胞中，Bcl—2的表达较低，因此导致大量不成熟B细胞死亡，而在成熟B细胞中，Bcl-2的表达量则较高。体外及体内实验均证实Bax、Bak广泛表达，可促使淋巴细胞凋亡．单独敲除Bax或Bak的小鼠其免疫表型的变化不是很显著，缺失Bax小鼠只有轻度的淋巴细胞增生，而缺失Bak小鼠则变化不大，而Bak及Bax同时缺失的小鼠则出现了很大的变化，Bax-／-Bak-／-小鼠脾及淋巴结可增大30倍，大量堆积T、B淋巴细胞，且主要为记忆细胞。

p53基因：p53是一种重要的抑癌基因，是Bcl—2和Bax的上游调节基因，与Bax启动子的p53结合位点结合后上调bax，下调bcl—2的表达促进细胞凋亡。研究发现p53基因剔除的鼠骨髓中早前期B细胞数量较正常鼠增多，且此细胞群体的凋亡频率较正常对照组明显降低，而p53鼠的前期B及未成熟B细胞的凋亡动力学与正常鼠相比无明显变化。这些结果说明，p53基因对于淋巴细胞的凋亡也有一定的调节作用。

细胞因子：细胞因子是一类调节细胞凋亡的重要生物活性分子。发现一些细胞因子如TGF—β，TNF有促进凋亡作用，另一些细胞因子具有抑制凋亡作用如GM—CSF、IL-2，研究发现细胞因子是免疫细胞通过自分泌或旁分泌作用于细胞表面细胞因子受体发挥对细胞凋亡的调节作用。这种作用涉及到免疫反应的许多方面，对免疫细胞的发育，活化等方面均具有重要作用。

3．凋亡与自身免疫性疾病

细胞凋亡与机体免疫之间有着极为密切的关系。值得指出的是，凋亡本身也可以介导自身免疫，在某些情况下，存在于凋亡细胞内的自身抗原可被自身反应性系统识别而激发自身免疫反应，从而导致自身免疫性疾病的发生发展。有关调亡与免疫失控及导致自身免疫性疾病的发生有以下几种解释：①淋巴细胞凋亡减少，导致自身反应性T、B细胞和巨噬细胞不适当的生存。②在器官特异性自身免疫性疾病的发病过程中，各种效应细胞，包括CD8+T细胞，CD4+Thl细胞，NK细胞及巨噬细胞等细胞的生存延长，其本身则通过FasL或TNFa或穿孔素的表达／释放，诱导靶器官的凋亡，造成组织的损伤。③一些器官(如辜丸、晶状体)有保护性配体，以防活化的免疫细胞的损伤，但当这些保护性配体失去时，活化的效应细胞则可导致靶器官的损伤。④细胞因子可以调节靶组织细胞表面死亡受体的表达，导致调亡的增加。⑤凋亡过程中产生的凋亡小体作为自身抗原，进一步刺激机体自身抗体的产生．
3．1系统性红斑狼疮：
在人类红斑狼疮中研究较多的为Fas／FasL。迄今为止，在人类仅发现少数SLE患者存在
fas和fasL基因的缺陷，但无论fas基因缺陷还是fasL基因缺陷的人类患者都很少出现SLE的典型临床表现肾炎症状，可见基因突变并不是人类狼疮发生的普遍病因。大样本的实验研究表明，SLE患者的外周血单个核细胞(PBMC)总体凋亡率较正常人要高，而自身反应性T、B淋巴细胞凋亡率降低，同时还伴有肾小球细胞凋亡减少和角质形成细胞凋亡加快等细胞凋亡紊乱。已有报道，SLE患者PBMC表面Fas和FasL表达增高，mFas在激活T细胞、静止T细胞及记忆T细胞亚群均表达上调。文献关于SLE病人血清游离Fas(souble
Fas，sfas)水平的报道并不一致。Silvestris等发现活动期狼疮病人外周血T细胞凋亡增加且与血清增加的sFas水平相关，而且，体外sFas培养CD3'细胞可抑制其增生并促进了Caspase活化和凋亡。Bijl
M等