双峰驼自然发酵乳对小鼠腹水型肝癌细胞H_22_的影响.pdf

中国奶牛 2009 年第 1 期目前治疗肿瘤临床上常采用手术加化疗或放疗的方法来控制疾病发展，然而化疗对骨髓造血和免疫功能的毒副作用，常使有效治疗难以进行。因此，寻找既能起到良好的抗肿瘤作用，又能保护免疫功能的治疗手段，是当今抗肿瘤药物的研究热点。有研究证实，乳酸菌及其发酵的酸奶具有预防和抑制肿瘤的作用，且这种抗肿瘤作用与其免疫活性存在着密切的联系。本研究利用内蒙古锡林郭勒盟苏尼特地区具有高营养价值和保健功效的苏尼特双峰驼自然发酵乳为研究对象，研究其对接种了肝癌H22细胞小鼠肿瘤生长的影响，以探讨苏尼特双峰驼自然发酵乳在体内是否有抑瘤作用。1材料和方法1.1材料苏尼特双峰驼自然发酵乳由内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗牧民家采得。清洁级昆明系小白鼠，雌雄各半，8周龄，体重1820g，由内蒙古大学实验动物中心提供。摘要：为了观察苏尼特双峰驼自然发酵乳在体内对小鼠腹水型肝癌H22细胞的细胞周期变化的影响，采取在给小鼠接种肿瘤前4天给予苏尼特双峰驼自然发酵乳，接种肿瘤后继续按预定剂量给予12d的方法进行试验，然后计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数，检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达率，用流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化。结果表明苏尼特双峰驼自然发酵乳高剂量组的抑瘤率为35.83%，中剂量组为31.94%，低剂量组为15.56%；脾脏指数、胸腺指数都显著提高（P0.01或P0.05）；苏尼特双峰驼天然发酵乳对小鼠H22肝癌肿瘤组织的PCNA表达有下调作用，可阻止肿瘤细胞的增殖，抑制其生长。流式细胞仪检测发现，苏尼特双峰驼自然发酵乳可使肿瘤细胞的细胞周期阻滞在S期。因此说明，苏尼特双峰驼自然发酵乳在体内有抑瘤作用，其机制与提高机体免疫力，使细胞周期阻滞并可能继而诱发凋亡有关。关键词：自然发酵乳；肿瘤细胞；肿瘤免疫；细胞周期Effects of Naturally Fermented Bactrian Camels Milk on H22Cells of Mice Ascites CarcinomaGuo Jiangong1，Wang Chuyi2，HasiSurong2，Jirimutu1(1.Key Lab of Dairy Biotechnology and Bioengineer,Education Ministry of P.R China College of Food Science and Engineering,InnerMongolia Agricultural University,Hohhot 010018；2.College of Animal Science and Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot,010018）Abstract：To observe the effects of the naturally fermented milk from Sonid Bactrian camels on cells and cell cycle of H22mice ascitescarcinoma in the body，the mice were given the naturally fermented milk from Sonid Bactrian camels for 12 days according to the given dose 4days before tumor inoculation and after tumor inoculation.Then we calculated the inhibitory rate of tumor,spleen index,thymus index,detected Proliferation Cell Nuclear Antigen(PCNA)and tumor cell cycle with flow cytometric.The results showed that the inhibitory rate is 35.83percent in SH naturally fermented milk group,31.94 percent in SM group and 15.56 percent in SL group；the spleen index,thymus indexhave significantly enhanced(P0.01 or P0.05)；The naturally fermented milk from Sonid Bactrian camels has a down regulation effect on expressionof PCNA of the mice H22hepatoma tumor tissue，and prevents the proliferation of tumor cells，as well as inhibits their growth.The result offlow cytometry detection showed that sonid Bactrian camel naturally fermented milk could block the tumor cells cell cycle in S phase.Thenaturally fermented milk from Sonid Bactrian camels has anti-tumor effect in vivo,and its mechanism is associated with improving immunity,cell cycle arrest and may then induced apoptosis.Key words:Naturally fermented milk；Tumor Cells；Tumor Immunity；Cell Cycle收稿日期：20081129作者简介：郭建功(1984-)，男，汉族，硕士研究生，研究方向为乳品科学。通讯作者：吉日木图(1965-)，男，蒙古族，副教授，博士，研究方向为食品科学。科学研究科学研究双峰驼自然发酵乳对小鼠腹水型肝癌细胞 H22的影响郭建功1，王初一2，哈斯苏荣2，吉日木图1（1.内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018；2.内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特010018）中图分类号：TS252.54文献标识码：A文章编号：10044264（2009）010009039 中国奶牛 2009 年第 1 期图1苏尼特双峰驼自然发酵乳对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用注：*表示与对照组比较差异极显著（P0.01）；*表示与对照组比较差异显著（P0.05）。下同。RPMI 1640，为Gibco公司产品。小鼠肝癌细胞株H22，由内蒙古医学院提供，在本实验室以腹水传代保种。流式细胞仪（FACS420型），为美国BD公司产品。PNCA单克隆抗体（小鼠IgG）、超敏SP（鼠和兔）试剂盒、碘化丙啶（PI）均购自武汉博士德生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯，使用时按需要配制。1.2方法将小鼠随机分为自然发酵乳高（SH）、中（SM）、低（SL）剂量组和阴性对照组（Control）共4组，每组10只小鼠，分别于接种肿瘤前4天以灌胃方法给予苏尼特双峰驼自然发酵乳1.0mL、0.5mL、0.2mL和相应剂量的生理盐水（NS），每天灌胃2次。接种肿瘤1后继续按预定剂量给予自然发酵乳12d，常规饲养，饮水、食物不限。于末次给自然发酵乳24h后，颈椎脱臼处死全部小鼠，检测肿瘤相关指标。1.2.1双峰驼自然发酵乳体内抑瘤率的测定对试验结束时处死的全部小鼠，剥取其皮下实体瘤块称重，计算抑瘤率。局部实体瘤生长的抑制率（%）=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重100%。1.2.2各组小鼠脾脏和胸腺指数变化的测定小心取出处死后小鼠的完整脾脏和胸腺称重，计算脾脏指数和胸腺指数。脾脏指数（Spleen Index,SI）=脾重（mg）/体重（g）10；胸腺指数（Thymus Index,TI）=胸腺重（mg）/体重（g）10。1.2.3检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达率取试验小鼠肿瘤组织，观察苏尼特双峰驼自然发酵乳对小鼠肝癌H22肿瘤组织中PCNA表达的影响。将做好的肿瘤切片（4m厚）按照朱玉娟等的方法2进行PCNA的测定：各组肿瘤组织的石蜡切片经脱腊、脱水、消除内源性过氧化物酶的活性后，再在0.01%枸橼酸盐缓冲液中进行抗原热修复。依次滴加10%正常羊血清封闭,加入一抗4孵育过夜,再加入二抗室温孵育1h，加入ABC液室温放置1h,DAB显色,苏木素复染，脱水透明封片，显微镜40倍目镜下计数阳性细胞占总细胞百分率，定量分析PCNA表达率3。1.2.4荷瘤小鼠肿瘤细胞的细胞周期变化采用李红喆等的方法4用机械法将新鲜肿瘤组织剪碎,用200目尼龙网过滤成单细胞悬液,每份取细胞1106个左右,PBS冲洗2次,离心弃上清,沉淀置于70%冷乙醇中固定30min以上，按常规方法进行碘化丙啶（PI）染色，用流式细胞仪检测分析不同DNA含量的细胞周期分布。1.2.5统计学分析所有数据均以平均数标准差（s）表示，采用SAS9.0版统计学软件进行方差分析和t检验。2结果与分析2.1双峰驼自然发酵乳的体内抑瘤率双峰驼自然发酵乳对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用见图1。由图1可以看出，双峰驼自然发酵乳对小鼠体内肿瘤细胞的生长有一定抑制作用，随着其剂量的增加，肿瘤重量依次减小，高剂量组抑瘤效果最好，对肿瘤抑制率高达35.83%。说明苏尼特双峰驼自然发酵乳对小鼠体内肿瘤细胞的生长有较显著的抑制作用，有杀伤癌细胞和抑制肿瘤细胞增殖的作用。2.2各试验组小鼠脾脏指数和胸腺指数的变化双峰驼自然发酵乳对小鼠脾脏指数及胸腺指数影响的实验结果见图2。图2结果表明，自然发酵驼乳组小鼠，高、中剂量组的脾脏和胸腺相对重量均显著高于对照组；高、中剂量组小鼠的脾脏指数和胸腺指数与对照组相比差异显著。说明自然发酵驼乳组小鼠的免疫功能明显增强，自然发酵驼乳有增强机体免疫功能的作用。2.3PCNA表达率测定PCNA后发现，阴性对照组荷瘤小鼠肿瘤组织PCNA具有较高的阳性表达率；荷瘤小鼠经灌服不同剂量自然发酵乳后，其肿瘤组织PCNA的表达量有明显降低趋势，结果见图3。高剂量组肿瘤组织阳性细胞率仅为28.87，明显低于对照（63.24）。由此可见，苏尼特双峰驼自然发酵乳对荷H22肝癌小鼠肿瘤组织的PCNA表达有明显下调作用，从而可阻止肿瘤细胞的增殖，抑制其生长。2.4荷瘤小鼠肿瘤细胞的细胞周期变化采用流式细胞仪检测了各组小鼠单个肿瘤细胞的科学研究科学研究图2四组荷瘤小鼠脾脏和胸腺相对重量及脾脏和胸腺指数的比较10 中国奶牛 2009 年第 1 期图4苏尼特双峰驼自然发酵乳对肿瘤细胞细胞周期的影响组别SHSMSL对照表 1苏尼特双峰驼自然发酵乳对肿瘤细胞细胞周期的影响 单位：%G1 期17.530.03*23.080.02*24.840.0226.460.02S 期63.520.04*53.150.02*51.730.01*49.440.01G2 期11.940.0517.560.0218.140.0216.170.04细胞周期变化，结果如图4和表1。图4和表1结果表明，高、中剂量组肿瘤细胞S期比率较对照组极显著增多（P0.01），低剂量组的S期比率较对照组也明显增多（P0.05）。说明自然发酵驼乳可使肿瘤细胞阻滞在S期。3讨论研究结果表明,苏尼特双峰驼自然发酵乳具有提高机体免疫功能和杀伤癌细胞、抑制肿瘤细胞增殖的作用。脾脏是血液通路中的滤过器官，也是体内最大的免疫器官。胸腺是胚胎期发生最早的淋巴组织，为T细胞的发源地，是免疫系统的中心器官。胸腺指数与脾脏指数是反映机体胸腺和脾脏免疫功能的重要指征之一，其数值高低的变化可以反映机体免疫功能的状态。自然发酵驼乳组小鼠的脾脏、胸腺指数均高于或明显高于对照组，说明自然发酵驼乳对机体免疫功能有增强作用。PCNA亦称周期素（cyclin），广泛存在于增殖活跃的细胞中，参与细胞周期的调控，是DNA聚合酶的辅助蛋白，对DNA的合成起着重要的调节作用，PCNA表达率的高低与恶性肿瘤细胞的生物学行为有着极密切的关系，是反映细胞增殖状态的重要指标。实验结果显示，与对照组相比较，给予驼乳组荷瘤小鼠肿瘤组织PCNA的表达率有明显降低趋势。这说明苏尼特双峰驼自然发酵乳对荷瘤小鼠肿瘤组织PCNA的表达有下调作用。可阻止肿瘤细胞的增殖，抑制其生长。肿瘤的发生、发展不仅与瘤细胞的增殖有关，亦与其凋亡有关。乳酸菌具有直接抑制肿瘤，促进机体免疫机能增强，阻滞肿瘤细胞的细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡等作用5，6。细胞周期主要分为:G1、S、G2及M期。G1期是细胞合成前期，产生大量rRNA、mRNA、tRNA、核糖体，合成大量的蛋白质，到G1晚期，大量合成与DNA合成有关的酶，S期是DNA合成时期，G2期是为细胞分裂准备物质条件的时期,M期是分裂期。研究结果表明，高、中剂量组小鼠肿瘤细胞的G1期细胞占细胞总数的比率较对照组明显下降（P0.01和P0.05）；高、中、低剂量组肿瘤细胞S期细胞占细胞总数的比率较对照组明显增高（P0.01和P0.05）。说明自然发酵驼乳可使肿瘤细胞阻滞在S期，但未能诱导凋亡。H22细胞在苏尼特双峰驼自然发酵乳的作用下，随着时间的延长,G1期细胞的比率逐渐下降，而S期细胞的比率则逐渐升高,并形成S期阻滞，表明苏尼特双峰驼自然发酵乳可阻滞细胞从S期进入G2期，从而使S期的细胞堆积，细胞增殖受抑制。提示苏尼特双峰驼自然发酵乳所致的细胞周期阻滞可能进一步引起细胞凋亡，这也可能是苏尼特双峰驼自然发酵乳抗肿瘤作用的机制之一。综上研究表明,苏尼特双峰驼自然发酵乳具有较好的抑瘤、杀瘤效应,但目前对其机制的研究还很肤浅，对其有效抗肿瘤成分尚需进一步深入探讨其结构与功能的关系，并运用现代生物技术、高密度发酵技术，培养活体细胞及有效代谢产物，从而为驼乳及其发酵品的开发利用提供可靠的实验依据。参考文献1陈涛，陈龙飞，金国琴，李丹.珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究J.肿瘤，2006;26:144-148.2朱玉娟，周爱玲，茅家慧，胡亚娥，朱燕.苦参素对实验性肝癌PCNA、cyclinD1、CDK4表达的影响J.中国临床药理学与治疗学，2005，6（1）：52-55.3韦翠萍.FAC抗肿瘤作用及其机制研究D.苏州：苏州大学基础医学系，2006.4李红喆，范晓磊，张丽.参杞合剂对荷瘤小鼠免疫功能及细胞周期的影响J.中国免疫学杂志，2003,6（19）:397-400.5顾瑞霞，伊萌，等.乳酸菌抗肿瘤特性的研究进展J.中国微生态学杂志，1999.8，11（4）:253-255.6郭伟剑，于尔辛，郑颂国，等.健脾理气药诱导人肝癌细胞SMMC27721凋亡的研究J.世界华人消化杂志，2000，8（1）:52-55.科学研究科学研究图3苏尼特双峰驼自然发酵乳对荷瘤小鼠PCNA表达率的影响11