热盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞凋亡.pdf

热盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞凋亡及其调控基因蛋白表达影响的实验研究西安市中心医院消化科(西安710003)张玲霞张沥徐俊荣贾长河张宁霞曹广周摘要目的:研究热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织中的凋亡细胞及其调控基因Bcl22、Fas表达状态,以探讨长期热咸饮食与慢性萎缩性胃炎发生的关系。方法:采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口末端标记(TUN EL)技术及免疫组织化学染色技术。细胞凋亡时DNA含量分析采用流式细胞检测技术。结果:TUN EL检测细胞凋亡显示,在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎中凋亡细胞数明显增多,在粘膜全层均可见到,呈弥漫性分布。萎缩性胃炎中凋亡细胞指数显著高于正常大鼠胃粘膜;免疫组化法检测凋亡相关基因显示,Bcl22、Fas在热盐水灌胃所致的萎缩性胃炎中的表达率显著高于正常胃粘膜;热盐水灌胃不同时间大鼠胃粘膜中Bcl22、Fas蛋白表达率随灌胃时间延长而逐渐增加,在4周、8周、12周时Bcl22蛋白表达率分别为12.5%、16.7%、76.5%,Fas蛋白表达率分别为18.75%、22.2%、64.7%;流式细胞检测显示,在萎缩性胃炎时,在G0?G1峰前可见一个亚G0?G1峰,也即凋亡细胞峰出现,而在正常胃粘膜时未显示亚G0?G1峰。结论:热盐水灌胃可导致大鼠胃粘膜组织细胞凋亡异常,其调控基因(Bcl22、Fas)在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎发生中起重要作用。主题词胃炎,萎缩性?病理学氯化钠类?副作用细胞凋亡基因,调节大鼠本研究采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口末端标记(TUN EL)技术、流式细胞检测技术及免疫组织化学染色技术对热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎胃粘膜上皮组织中的凋亡细胞及其调控基因(Bcl22、Fas)表达状态进行观察,以探讨它们在热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎发生中所起的作用,探讨食物的温度及咸度造成胃粘膜萎缩的原因,为预防胃癌前病变和胃癌的发生提供实验依据。材料与方法1材料100只7周龄健康、性成熟的雄性SD大鼠,体重200250g,由第四军医大学动物实验中心提供;细胞凋亡试剂盒(In Situ CellApoptosis Detction Kit I,POD),SABC、即用型试剂盒、Bcl22、Fas一抗、生物素化的二抗均购自武汉博士德生物技术公司;流式细胞检测采用U SA2Coulter公司流式细胞仪(EL ITE型)。2方法2.1大鼠萎缩性胃炎模型的制作:采用55、15%的盐水连续灌胃12周,制成大鼠萎缩性胃炎模型,在灌胃期间每隔4周处死一批大鼠。对照组采用等量的蒸馏水灌胃12周。具体造模方法见参考文献1。收集制模阶段的大鼠胃粘膜石蜡包埋标本68例(其中萎缩性胃炎标本34例)及对照组大鼠胃粘膜石蜡包埋标本32例进行检测。2.2细胞凋亡的检测:采用末端转移酶介导的dU TP切口末端标记法(TUN EL)。染色步骤:4m石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化;新鲜配制3%H2O2及90%甲醇混合液封闭,室温处理10m in阻断内源酶;加TBS1:100稀释Proteinase K37消化15m in;加标记缓冲液(L abeling Buffer)20l?片,以保持切片湿润,4过夜20h,取出再置37标记2h;加封闭液50l?片,室温30m in;用封闭液1100稀释生物素化抗地高辛抗体,50l?片,37反应30m in;用TAB1100稀释SABC,混匀后加至切片,012陕西医学杂志2003年3月第32卷第3期37反应30m in;23步后蒸馏水洗涤3次,每次2m in;67步后TBS洗涤3次,每次2m in;DAB2H2O2显色10m in,苏木素轻度复染,脱水透明,封片。2.3免疫组织化学染色:采用SABC即用型试剂盒,切片常规脱蜡水化,经3%过氧化氢290%甲醇封闭内源性过氧化物酶20m in,微波修复抗原10m in,山羊血清孵育25m in后加一抗(P53、ras),4冰箱过夜,次日加对应的生物素化二抗,37,30m in;ABC复合物,37,30m in。之后用DAB显色。以上各步骤除血清孵育后甩干血清直接加一抗外,均间以PBS洗涤3次,每次35m in。显微镜下观察DAB显色满意后自来水冲洗5m in;苏木素复染5 s,自来水冲洗5m in;最后脱水,透明,封片。2.4 流 式 细 胞 检 测 技 术:采 用U SA2Coulter公司流式细胞仪(EL ITE型)进行检测。将石蜡包埋组织(50m厚组织切片)放入试管中,经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化;加入胃蛋白酶(pH1.5)消化30m in,经350目尼龙网过滤,离心(500800r?m in);收集细胞悬液,以预冷的70%乙醇固定待检;P I(碘化丙啶)染色,在4暗处避光30m in,用流式细胞仪进行检测,观察细胞周期分布。3判断标准光学显微镜下观察显色反应并计数。凋亡细胞指数判定参照许岸高等2的标准,即每张切片观察5个视野,每个视野计数100个细胞,计数中凋亡细胞比率的均数为凋亡指数。Bcl22、Fas阳性染色为棕黄色颗粒,每个视野阳性细胞数小于5%为阴性(-),大于5%时为阳性(+)3。4统计学方法采用t检验及卡方检验。结果1TUN EL检测细胞凋亡热盐水致大鼠萎缩性胃炎中凋亡细胞的阳性反应物质为棕黄色,位于细胞核内。在正常大鼠胃粘膜,凋亡细胞主要位于表面上皮内,呈簇状分布或单个散在分布。热盐水致大鼠萎缩性胃炎中凋亡细胞数明显增多,在粘膜全层均可见到,呈弥漫性分布,其凋亡细胞指数显著高于正常大鼠胃粘膜,见表1、图1。表1大鼠正常胃粘膜、萎缩性胃炎中Bcl22、Fas蛋白表达率病理检查nBcl22蛋白表达阳性例数%Fas蛋白表达率阳性例数%正常胃粘膜32412.5618.7萎缩性胃炎342676.52264.73注:3 与正常胃粘膜比较,P 0.012免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl22、Fas阳性反应物呈棕黄色,主要位于胞浆中,个别病例在胞核中也有表达,见图2、3。Bcl22、Fas在热盐水致大鼠萎缩性胃炎中的表达率显著高于正常胃粘膜(P 0.05),见表2。热盐水灌胃不同时间大鼠胃粘膜中Bcl22、Fas蛋白表达率随灌胃时间延长而逐渐增加,见表3。表2大鼠正常胃粘膜、萎缩性胃炎中Bcl22、Fas蛋白表达率病理检查nBcl22蛋白表达阳性例数%Fas蛋白表达率阳性例数%正常胃粘膜321443.75412.5萎缩性胃炎342676.5#2264.73注:3 与正常胃粘膜比较,P 0.01,#与正常胃粘膜比较,P 0.053流式细胞检测大鼠灌胃致粘膜萎缩时,在G0?G1峰前可见一个亚G0?G1峰,也即凋亡细胞峰出现,而在正常胃粘膜时未显示亚G0?G1峰。表3热盐水灌胃不同时间大鼠胃粘膜中Bcl22、Fas蛋白表达率时间(周)nBcl22蛋白表达阳性例数%Fas蛋白表达率阳性例数%416212.5318.75818316.7422.212342676.532264.73正常组32412.5618.75注:3 与正常胃粘膜比较,P 0.05讨论慢性萎缩性胃炎属于癌前状态,它是胃癌发生的重要环节。在对慢性萎缩性胃炎患者1020年的随访发现,有5%10%的患者发生了胃癌,112陕西医学杂志2003年3月第32卷第3期且胃癌的发病率随着追踪时间的延长而增加4。近年来流行病学研究表明,长期高盐饮食可以导致慢性萎缩性胃炎,甚至诱发癌变5,而在此过程中,细胞凋亡及其调控基因起着极其重要的作用。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡的过程,是程序性细胞死亡的主要形式6,7。正常情况下,细胞凋亡与细胞增殖保持着一定的生长规律,当细胞正常增殖和分化被扰乱,导致细胞过度增殖和凋亡异常时,就会诱发疾病的发生8。研究表明,在从正常胃粘膜萎缩性胃炎过程中,细胞凋亡指数呈递增趋势。本研究采用自行建立的热盐水致大鼠萎缩性胃炎动物模型1的胃粘膜组织标本,运用脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口末端标记(TUN EL)技术、免疫组化技术及流式细胞检测技术对其粘膜上皮组织中的凋亡细胞和Bcl22、Fas蛋白表达状况进行观察。结果显示,正常胃粘膜中凋亡细胞很少,而随着热盐水灌胃时间延长,胃粘膜逐渐出现萎缩,粘膜组织中凋亡细胞随萎缩程度加重其表达也逐渐升高,表明热盐水灌胃可刺激胃粘膜组织细胞发生变化,在这一过程中存在着活跃的细胞增殖和大量的细胞凋亡,即细胞的不稳定性明显增加。Bcl22基因编码一个2526kD的蛋白,其C末端的21个疏水氨基酸组成一个延伸的链状结构,这个链可插入到细胞的膜结构中,这一结构特点与Bcl22调节细胞凋亡的方式和能力非常有关9。本研究发现,随着热盐水灌胃时间延长,胃粘膜逐渐出现萎缩,粘膜组织中Bcl22蛋白表达率呈逐渐增加的趋势,表明Bcl22蛋白表达异常在热盐水灌胃导致胃粘膜组织细胞异常变化中具有重要的调控作用。Fas是细胞表面可以传递死亡信号的受体,其作为一种细胞膜抗原,主要功能是介导细胞凋亡,具有抵抗Bcl22蛋白抑制细胞凋亡的作用8,10。许多研究发现Fas在胃癌组织中呈低表达,在正常粘膜中高表达2,3,11,12。本研究结果与之相反,Fas在正常组织中低表达,而在萎缩组织中呈高表达,在4周及8周时表达量少,与正常组相比,差异无显著意义;在12周时表达率达64.7%,与正常组相比,差异有显著意义(P 0.05)。我们认为,大鼠胃粘膜组织中Fas表达与人胃粘膜组织中Fas的表达可能存在某种差异,仍需要我们再进一步深入研究。本研究结果提示,热盐水灌胃引起大鼠胃粘膜萎缩可能与热盐水刺激造成胃粘膜上皮细胞凋亡及其调控基因失控有密切关系,从而从分子水平上支持了长期热咸饮食与慢性萎缩性胃炎及胃癌形成有关这一推论,为慢性萎缩性胃炎及胃癌的防治提供了理论依据。(本文图片见封4)参考文献1张沥,张玲霞,徐俊荣,等.热盐水致大鼠萎缩性胃炎模型建立.世界华人消化杂志,2002;105712许岸高,李韶光,刘集鸿,等.胃癌癌前病变演化与细胞凋亡和增殖的关系.中华医学杂志,1999;791853高善玲,钱素娟,刘巍.胃癌细胞凋亡及其相关基因的研究.中国肿瘤临床,1999;266324马宵.胃癌基础与临床.西安:西安交通大学出版社,19991371385Fox JG,Dangler N S,Taylor N S,et al.H igh2Saltdiet induces gastric epithelial hyperplasia and parietalcellloss,andenhancesHelicobacterpyloricolonization in C57BL?6 m ice.Cancer Res,1999;5948236Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis andtreatment of disease.Science,1995;26714567Q ue FG,Gores GJ.Cell death by apoptosis:basicconceptsanddiseaserelevanceforthegasreoenterologist.Gastroenterology,1996;11012388彭黎明,王曾礼主编.细胞凋亡的基础与临床.北京:人民卫生出版社,20004124139彭黎明,王曾礼主编.细胞凋亡的基础与临床.北京:人民卫生出版社,200011211910张玲霞,张沥.细胞凋亡及其调控基因与萎缩性胃炎.世界华人消化杂志,2002;1058111王成龙,谭家麟.胃癌发生发展中Fas、FasL和Bcl22的表达.中国肿瘤,2001;104612贾百灵,李立,雷霖,李继晶.胃腺癌发生过程中Fas、Bcl22蛋白的表达变化.中国误诊学杂志,2002;2980(收稿:2002210223)212陕西医学杂志2003年3月第32卷第3期本期责任编辑贾明陕西医学杂志SHAANX I Y IXU E ZA ZH ISHAANX IM ED ICAL JOURNAL(月刊)2003年第32卷第3期(总第333期)1972年2月创刊主编杨世兴主办陕西省卫生厅(西安市莲湖路34号,710003)编 辑 出版陕西医学杂志编辑部(西安市西华门2号,710003)排版陕西医学杂志编辑部微机室印刷陕西省委机关印刷厂总发行陕西省邮政报刊发行局订阅处全国各地邮局(所)发 行 范围公开发行Edited by:EditorialBoard of ShaanxiM edicalJournalChief Editor:Yang ShixingPublished by:ShaanxiM edical Journal A dd:No.2 Xihuamen,Xian 710003,China出版日期2003年3月20日国际标准刊号ISSN 100027377中国标准刊号CN 6121104?R邮发代号52240广告经营许可证6101004004020定价全年66.00元每册5.50元