酶联免疫吸附试验elisa.pptx

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验elisaelisa酶联免疫吸附试验elisa第1页免疫标识技术免疫标识技术1.1.定义：定义：将抗原将抗原-抗体反应与标识技术相结合，用抗体反应与标识技术相结合，用放射性放射性同位素、酶或荧光素同位素、酶或荧光素标识已知抗体或抗原，经过检标识已知抗体或抗原，经过检测标识物，间接测定未知抗原或抗体。测标识物，间接测定未知抗原或抗体。2.2.分类：分类：放射免疫测定法：放射免疫测定法：131131I I，3232P P免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITCFITC，PEPE免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRPHRP，APAP酶联免疫吸附试验elisa第2页免疫酶测定法免疫酶测定法(E Enzyme nzyme I ImmunommunoA Assay,EIA)ssay,EIA)用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)(HRP)(HRP)，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶(AP)(AP)(AP)(AP)特点：特点：特点：特点：高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高灵敏度：酶催化底物显色高效性，高灵敏度：酶催化底物显色高效性，高灵敏度：酶催化底物显色高效性，高灵敏度：酶催化底物显色高效性，pgpgpgpg水平微量检测水平微量检测水平微量检测水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类：分类：分类：分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：组织中或细胞表面抗原。组织中或细胞表面抗原。组织中或细胞表面抗原。组织中或细胞表面抗原。酶联免疫吸附试验elisa第3页酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E Enzyme-nzyme-L Linked inked I ImmunommunoS Sorbent orbent A Assay,ELISA)ssay,ELISA)用酶标识抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标识抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原方法。中未知抗体或抗原方法。1.1.定义定义2.2.原理原理（1 1）利用抗原与抗体特异反应将待测物与）利用抗原与抗体特异反应将待测物与酶连接。酶连接。（2 2）经过酶与底物产生颜色反应，用于定）经过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。量测定。测定对象能够是抗体也能够是抗原。测定对象能够是抗体也能够是抗原。酶联免疫吸附试验elisa第4页3.3.常见常见种类种类直接法（直接法（直接法（直接法（direct ELISAdirect ELISA）：）：）：）：将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体检测抗体检测抗体间接法（间接法（间接法（间接法（Indirect ELISAIndirect ELISA）：）：）：）：将已知抗原吸附于固相载体，加酶标识二抗将已知抗原吸附于固相载体，加酶标识二抗检测检测液相中未知抗体液相中未知抗体双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（Sandwich ELISA)Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标识一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标识一抗检测液相中检测液相中可溶性抗原可溶性抗原竞争法（竞争法（竞争法（竞争法（Competitive ELISA)Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标识抗原或抗体将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标识抗原或抗体检测液相中可溶性检测液相中可溶性抗原或抗体抗原或抗体阻断法（阻断法（阻断法（阻断法（Block ELISA)Block ELISA)：将已知抗原吸附于固相载体，酶标识单克隆抗体将已知抗原吸附于固相载体，酶标识单克隆抗体检测液相中可溶性检测液相中可溶性抗体抗体酶联免疫吸附试验elisa第5页（1 1 1 1）直接法测定抗原直接法测定抗原直接法测定抗原直接法测定抗原A.A.A.A.将抗原吸附在载体表面；将抗原吸附在载体表面；将抗原吸附在载体表面；将抗原吸附在载体表面；B.B.B.B.加酶标抗体，形成抗原加酶标抗体，形成抗原加酶标抗体，形成抗原加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；抗体复合物；抗体复合物；抗体复合物；C.C.C.C.加底物。底物降解量抗原量。加底物。底物降解量抗原量。加底物。底物降解量抗原量。加底物。底物降解量抗原量。酶联免疫吸附试验elisa第6页（2 2 2 2）间接法测定）间接法测定）间接法测定）间接法测定抗体抗体抗体抗体A.A.A.A.将将将将抗原抗原抗原抗原吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；B.B.B.B.加抗体加抗体加抗体加抗体,形成抗原形成抗原形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.加酶标抗体；加酶标抗体；加酶标抗体；加酶标抗体；D.D.D.D.加底物。测定底物降解量抗体量。加底物。测定底物降解量抗体量。加底物。测定底物降解量抗体量。加底物。测定底物降解量抗体量。酶联免疫吸附试验elisa第7页（3 3 3 3）双抗体双抗体双抗体双抗体夹心法测定夹心法测定夹心法测定夹心法测定抗原抗原抗原抗原A.A.A.A.将将将将抗体抗体抗体抗体吸附于固相表面吸附于固相表面吸附于固相表面吸附于固相表面;B.B.B.B.加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.加酶标抗体加酶标抗体加酶标抗体加酶标抗体;E.E.E.E.加底物。底物降解量抗原量。加底物。底物降解量抗原量。加底物。底物降解量抗原量。加底物。底物降解量抗原量。酶联免疫吸附试验elisa第8页（4 4 4 4）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原A.A.A.A.将抗体吸附在固相载体表面将抗体吸附在固相载体表面将抗体吸附在固相载体表面将抗体吸附在固相载体表面;B.B.B.B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原；C.C.C.C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量差未知抗原量。酶联免疫吸附试验elisa第9页（5 5 5 5）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体本本本本法法法法主主主主要要要要用用用用于于于于检检检检测测测测型型型型特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体体体体。该该该该方方方方法法法法现现现现已已已已成成成成为为为为猪猪猪猪传传传传染染染染性性性性胃胃胃胃肠肠肠肠炎炎炎炎（TGETGE）、猪猪猪猪伪伪伪伪狂狂狂狂犬犬犬犬病病病病（PRPR）及及及及猪猪猪猪胸膜肺炎（胸膜肺炎（胸膜肺炎（胸膜肺炎（APAP）主要检测方法。）主要检测方法。）主要检测方法。）主要检测方法。A.A.A.A.将抗原吸附在固相载体表面将抗原吸附在固相载体表面将抗原吸附在固相载体表面将抗原吸附在固相载体表面;B.B.B.B.先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）,形成抗原形成抗原形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.再加酶标单抗；再加酶标单抗；再加酶标单抗；再加酶标单抗；D.D.D.D.加底物。加底物。加底物。加底物。酶联免疫吸附试验elisa第10页酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)4.4.原理原理（以（以ELISA为例）为例）：显色显色显色显色酶标单抗酶标单抗酶标单抗酶标单抗酶联免疫吸附试验elisa第11页试验材料试验材料猪伪狂犬病毒（猪伪狂犬病毒（PRVPRV）抗原抗原阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照样品样品 待测猪血清待测猪血清HRPHRP标识猪标识猪PRVPRV单抗单抗 酶标单抗酶标单抗包被缓冲液：包被缓冲液：0.025M pH9.60.025M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液洗涤液：含洗涤液：含0.05%Tween 200.05%Tween 200.01M pH7.4 PBS0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液：底物缓冲液：pH5.0pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：底物溶液：TMBTMB（四甲基联苯胺）（四甲基联苯胺），底物缓冲液，底物缓冲液，30%H30%H2 2O O2 2，新鲜配制新鲜配制酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪阻断法测定猪伪狂犬病病毒阻断法测定猪伪狂犬病病毒ELISAELISA抗体抗体 定性检测定性检测酶联免疫吸附试验elisa第12页试验方法试验方法1.1.抗原处理：抗原处理：2.2.包被抗原：包被抗原：取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入100L/100L/100L/100L/孔抗原稀释液孔抗原稀释液孔抗原稀释液孔抗原稀释液4444，湿盒内，湿盒内，湿盒内，湿盒内，18h18h18h18h酶联免疫吸附试验elisa第13页取出包被好抗原酶标板（取出包被好抗原酶标板（4 4孔孔/组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次3.3.加待测血清加待测血清标识各孔，加入对应液体标识各孔，加入对应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性空空白白阳阳性性待待测测4.4.加单抗：加单抗：3737，湿盒内，湿盒内，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标单抗各孔加入酶标单抗100L/100L/孔孔3737，湿盒内，湿盒内，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min10min6.6.观察结果观察结果试验方法试验方法酶联免疫吸附试验elisa第14页1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原酶标板（依据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（、取已包被猪伪狂犬病毒抗原酶标板（依据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检）将待检血清血清1 1稀释后加入板孔中，每孔加稀释后加入板孔中，每孔加100l。一样。一样1 1稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔，每孔孔100l。另设一空白对照孔，空白对照孔加。另设一空白对照孔，空白对照孔加100l稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37温育温育30分钟。分钟。2、洗板：甩掉板孔中溶液，每孔加入稀释好洗涤液、洗板：甩掉板孔中溶液，每孔加入稀释好洗涤液200l，静置，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。次。3、每孔加酶标单抗、每孔加酶标单抗100l，置，置37温育温育30分钟。分钟。4、洗板：洗涤、洗板：洗涤3次（方法同时骤次（方法同时骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。）。切记每次在干吸水纸上拍干。5、显色与终止：每孔先加底物、显色与终止：每孔先加底物A液、再液、再B液各液各1滴滴(50l)，混匀。室温（，混匀。室温（18-25）避光显色）避光显色10分钟后。分钟后。6、终止：每孔加终止液、终止：每孔加终止液1滴滴(50l)（0.25%氢氟酸），终止反应。氢氟酸），终止反应。7、10分钟内测定结果。采取波长分钟内测定结果。采取波长630nm酶标仪测定酶标仪测定OD值。检测样本值。检测样本OD值值0.35为阳性为阳性8、结果判定：试验成立条件是：阴性对照孔平均、结果判定：试验成立条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均值与阳性对照孔平均OD630值之差值之差0.40.4。S=样品孔样品孔OD630值，值，N=阴性对照孔阴性对照孔OD630值值假如假如S/N比值比值0.60.6，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阳性。抗体阳性。假如假如S/N比值比值0.70.7但但 0.6 0.6，样品重测。，样品重测。假如假如S/N比值比值 0.7 0.7，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阴性抗体阴性详细操作步骤详细操作步骤酶联免疫吸附试验elisa第15页预期结果预期结果阴性：显色为阴性：显色为蓝色蓝色阳性：无色阳性：无色1 2 3 4阳性阳性阳性阳性 阴性阴性阴性阴性常见酶及底物常见酶及底物常见酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色棕黄色蓝色黄色酶联免疫吸附试验elisa第16页注意事项注意事项1、ELISA试验前血清样品尽可能做到试验前血清样品尽可能做到37灭活灭活30分钟。分钟。2、在、在ELISA整个操作过程中，洗涤是不可缺乏主要步骤，每加整个操作过程中，洗涤是不可缺乏主要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目标在于预防重合引一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目标在于预防重合引发非特异性吸附。洗涤过程中助溶剂吐温发非特异性吸附。洗涤过程中助溶剂吐温20含有降低非特异吸附含有降低非特异吸附作用。洗涤时尽可能除去未结合抗原及杂质，用力甩干。作用。洗涤时尽可能除去未结合抗原及杂质，用力甩干。3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。分钟内完成。酶联免疫吸附试验elisa第17页