WB实验基本步骤.docx

实验基本步骤

提取细胞蛋白
↓
BCA定量
↓
制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）
↓
蛋白样品变性
↓
电泳
↓
转膜
↓
封闭
↓
一抗
↓
TBST洗涤
↓
二抗
↓
TBST洗涤
↓
显影
↓
结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L
磷酸二氢钾 0.24g
磷酸氢二钠 1.44g
氯化钠 8g
氯化钾 0.2g
加入500ml纯水，调PH=7.2
定容至1L,高压蒸汽灭菌
2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）
500mlPBS+0.25ml吐温-20
3.电转液500ml
Tris 1.5g
甘氨酸 7.2g
400ml水溶解
加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷
4.电泳液（1X）
10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水
5.TBS
6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）
50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20
7.封闭液
TBST1X+5%奶粉
40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验
一、蛋白样品制备
准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4℃预冷
1. 于-20℃冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液
2. 加入1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃，8000r离心5min，然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。
3.按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5.裂解完后，于4℃下12000 rpm离心5 min。
7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
二、 蛋白含量的测定（BCA定量）
准备：96孔板，移液枪（1000ul，10ul，200ul），BCA工作液（A+B），50mlEP管，1xPBS，BSA标准液
1. 将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）
2. 算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）
3. 将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul
4. 配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液
5. 将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul
6. 每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差
7. 将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟
8. 孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存）
9. 计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10倍）

蛋白质定量标准曲线加样量

序号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白量/ul （0.5mg/ml）
0
1
2
4
8
12
16
20
背景液（PBS）/ul
20
19
18
16
12
8
4
0
标准液浓度mg/ml
0
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
三、SDS－PAGE电泳 
1.  配胶（12%,可以提前配好）
准备：玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4℃冰箱冷藏）
（1）玻璃板验漏5min
（2）按表配置分离胶
（3）灌胶，加酒精封压，凝30min（注意不要有气泡）
（4）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min
（5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用
2. 样品处理
准备：PBS，移液枪，1.5mlEP管
（1）稀释样品：一般每孔上样5ul，即1mg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至1mg/ml（注意loadingbuffer的加入也得算入）
（2）取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中，加入6×SDS 上样缓冲液3ul至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。）
（3）将样品在100℃煮5 min震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）
3.   电泳
准备：电泳液500ml（现配），蛋白胶，10ul移液枪（枪头），样品，Marker，冰盒，电泳装置
（1）将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板面向内，长玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。）
（2） 上样。用移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。）
（3）先设置80V，开始电泳，样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（此时准备好电转液）
四、转膜
准备：电转液（现配4℃冰箱冷藏），镊子，滤纸，PVDF膜（0.45um），电转装置，冰盒
注意：拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子，因为手上的蛋白会污染膜。
1.   在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫
2. 滤纸浸入电转液中，PVDF膜在甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4℃电转液中平衡至少5min。
3.   将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
5.  将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。一般用100mA转移90min。
6.  转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液）
六、免疫反应

准备：封闭液，一抗，二抗，TBST
1 .  将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
2.   TBST洗4次。每次5分钟。
3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h或者4℃过夜
4. 室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min
5.  同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗4次，每次5 min
七、显影
准备：样品胶片，移液枪（200ul），中枪头，吸水纸，显影液（A+B），薄镊子

一抗
二抗

目的蛋白78kd
Bip 1:1000
兔二抗
75kd

目的蛋白34kd
GAPDH内参1:5000
鼠二抗
28kd

目的蛋白17kd
Sep15 1:1000
兔二抗

1.  将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；
2. 1 min后，取适量显影液于显影仪台面上，将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触，注意切角在左上，即正面朝上。
应注意的是：显影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。 
3.盖上盖子，将胶片进行扫描或拍照。