Southern-Blot-实验流程(包括原理细节).docx
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1、Southern Blot 实验流程(包括原理/细节)一、DNA 的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚、氯仿抽提,经RNase 处理和纯化来提取DNA。(1)取单层细胞,经无钙、镁PBS洗一次,用0.25%胰蛋白酶消化,细胞悬液经PBS洗2次,弃上清,取细胞沉淀。(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL,pH8.0,0.1mol/L EDTA,10mmol/L NaCL,1%SDS)充分混匀,加入蛋白酶K 至终浓度为0.51g/L、Sarkosye终浓度为0.5%,混匀裂解蛋白呈糊状。(3)5
2、0水浴2h,转入37水浴过夜,次日加入等体积饱和酚,轻轻颠倒混匀,以防止DNA断裂,约3min。 12000r/min 离心15分钟(室温) (4)取水相,再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀,去除蛋白质12000 r/min 离心15分钟(室温)(5)再重复步骤(4),再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相,再加入等体积氯仿,去除酚及蛋白质,颠倒混匀12000 r/min 离心15分钟(室温)(7)取水相,加入2倍体积的预冷无水乙醇,沉淀DNA,混匀-20放置1小时12000 r/min 离心15分钟(室温)(8)用70%乙醇洗涤一次,按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。(9
3、)加入RNase A至终浓度100mg/L,37水浴消化1小时,消化污染的RNA。(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%,混匀,50水浴2小时,加入NaAC至终浓度10mmol/L。(11)用等体积饱和酚各抽提一次,步骤同前。(12)吸上清,加入氯仿/异戊醇(24:1),按上法再抽一次。(13)取水相,加入2倍体积预冷无水乙醇,-20 1小时。(14)取沉淀用70%乙醇洗一次,真空干燥10分钟后溶于少量TE中,4贮存。Southern对DNA的质量要求比较高,一般来说,高质量DNA 样品需具备以下几点: DNA 完整性好; DNA 纯度高; 勿用TE 溶解
4、DNA; DNA 浓度不低于0.7ug/ul,杂交需模板DNA 约20ug/泳道/次二、引物设计三、DNA 检测 1、DNA浓度的测定DNA浓度用紫外分光光度计测定,核酸的光吸收值位于波长260nm处,蛋白质则位于280nm,分别测定后,其OD260/OD280的比值应大于 1.8.低于此值,说明DNA中仍残留较多的蛋白质,此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏,断裂严重,已成为小分子,因此操作应轻柔。取少许DNA溶液,经紫外线扫描,吸收峰值位于波长260nm处,其纯度应为OD260/OD280=1.8,OD260值为1的溶液大约含50g/mL DNA,故DNA的浓度
5、(g/mL)=OD260值50g/mL稀释倍数。DNA总量(g)=DNA浓度(g/mL)总体积 (mL)2、DNA分子量的测定DNA分子量大小测定,可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定,根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小,此技术还可用作分离基因组 DNA,进一步进行Southern吸印分析。四、探针制备(以PCR 标记方法为例)1、标记原理Dig-dUTP 在Taq DNA 聚合酶的作用下,经基因特异的引物PCR 指数扩增,可掺入到新合成的DNA 分子中,从而完成DNA 探针的标记。在延伸反应中,每2025 个核苷可有一个Dig-dUTP 分子掺入到新合成的DNA 链中。
6、2、操作步骤1)探针标记注意:在探针标记前,必须用普通PCR 优化反应条件(试剂盒中提供了过量的Taq DNA 聚合酶及其Buffer,建议用于条件优化),包括引物、退火温度、延伸时间、模板量等,设定好最佳反应条件。任何非特异扩增可能导致高的杂交背景甚至假阳性。在标记反应的同时,用普通dNTP 做一个相同体系的非标记PCR 扩增。扩增体系: 组份D标加量Control加量10buffer (plus Mg2+) 2l 2l1l000.4l引物F/R1l 1l模板 1l 1l1l1l14l14.6lPCR扩增:95 5min; 95 30sec,60 35sec, 72 30sec; 72 5m
7、in; 30 cycles2)标记探针检测取标记产物和普通PCR扩增产物各1l,1.0%的琼脂糖凝胶电泳。由于大分子量的DIG掺入,标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记!其余标记产物-20保存。 如果要准确检测标记效率(一般不必),取标记产物1l和Dig标记的对照DNA,用DNA稀释液按 10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针,按杂交检测方法进行信号检测,然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比,推算出标记的探针浓度。如初始模板量较大,可取1l标记产物稀释10100倍后定量。五、基因组DNA 酶
8、切限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA,每种酶的特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同,应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37 1小时内能将1g DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶,要注意RE的最适盐浓度,要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。通常,10个单位的内切酶可以切割1g不同来源和纯度的DNA。在正式酶切之前先用20l小体系预酶切看是否切得动,然后用大体系37酶切过夜。1、酶切体系:组份加量10buffer4.5lHind 内切酶6.5l样品DNA 25gddH2O 补足水至45l,于37水浴中酶切2
9、0h每一种酶都有其相应的最佳缓冲液,以保证最佳酶活性,使用时的缓冲液浓度应为1。有的酶要求100g/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响酶切完后,取5l 酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上检测酶切是否充分。如果酶切充分,灌制1%的agrose胶,加入上样buffer后,在25-30V稳压电泳 12-24hrs(包括DNA Marker)。2、电泳1%浓度琼脂糖凝胶、TBE buffer(EB 染料电泳后染)100ml TBE buffer中加入10l 10mg/ml溴化乙锭(EB),将凝胶放置其中染色30分钟, 照相。六、转膜1、将胶裁成9.8cm8.0c
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