制备色谱概论 大连依利特公司.pdf

制备色谱概论制备色谱概论大连依利特分析仪器有限公司讲演者：李炳源制备色谱概论制备色谱的目的分离纯化样品。制备量：ngkg传统的分析定性或定量。仪器:台式的Prep-LC仪器及色谱柱流速范围大约是0.1300ml/min制备制备HPLC的策略的策略1：很高的生产效率和产量，收率很低。2：高纯品，但是生产效率和产量很低。3：峰在基线上被完全分开，产品纯度、产量和生产效率都达到最高。分离设计制备色谱准则：成本低，容量大，效率高。分离方法：基于实验尝试和经验分离设计基本方法：1.峰接触法2.峰重叠法增加待分离物进样量接触法原理示意图峰重叠法_微量组分在前微量组分在前，主峰对微量组分具有一定的顶替作用，峰宽没明显展宽微量组分峰重叠法_微量组分峰在后微量组分峰位于重叠主峰的后面，主峰对微量组分峰 具有拖带效应，随峰着进样量的增加，微量组分峰峰高增加很慢，但峰变得很宽。峰重叠法_接触法a.分析型色谱图，主峰后微量组分峰型b大剂量进样，微量组分峰与杂质主峰重叠c.用接触法分离b收集组分微量组分在主峰后微量组分在主峰后收集重叠峰接触法分离重叠峰接触法分离重叠峰提高制备样品纯度 通常制备色谱的分辨率较低 通过牺牲分辨率，换来每针更高的上样量是最通常的做法 仅仅收集一对色谱峰的前后两端，如下图一对未分开色谱峰的A及B部分 提高分辨率 再循环色谱 使用再循环方式 在等度色谱中把色谱峰未分开的部分从检测器流动池再回到泵每次循环分离增加每次循环分离增加1.41倍柱效，可循环倍柱效，可循环4-5次次制备方法步骤制备方法步骤1.创建分析方法。2.在分析柱上进行超量载样。3.放大到制备柱 流速(Flow Rate)，以线速度不变为原则以线速度不变为原则 上样量(Load)注 D=色谱柱内径，L=色谱柱长度制备量放大公式22)()(分析制备分析流速流速DD制备分析制备分析制备分析制备进样量进样量LLDD22)()(流速柱径2/25系统方法建立系统方法建立系统方法建立A:1g,4.6-250mm 1.0ml/minB:1g,4.6-250mm 3.4ml/minC:0.5mg,4.6-250mm 3.4ml/minD:5.3mg,1in.-250mm 72ml/min色谱柱-上样量-流速该幻灯片摘自张庆合作品Elite制备色谱仪的种类系统系统流速范围流速范围(ml/min)最大耐压最大耐压(psi)上样量范围上样量范围推荐色谱柱推荐色谱柱Delta 6000.01 20.006000g 1g8100 至25100Delta 600EF0.01 45.006000g 5g8200 至25200P rep-L C 40001 150.04000mg 25g25100 至47300Delta-P rep 40001 150.04000mg 25g25100 至47300P rep-L C 20004 300.02000mg 50g40200 至47/57300P230PP270P270P280P230P20Mpa1000.01-4030Mpa30MpaElite分析、制备柱P230p半制备系统270制备系统230+UV制备型检测器安装与调试1.安装：1.解除在运输用的锁定螺丝2.液路管道连接：弯管，梯度混合器，进样器，检测器，废液管，泵头清洗管3.电路连接：泵控线连接4.3725进样器安装2.泵参数设置3.工作站控制4.系统测试验收拆卸包装螺丝注意：螺丝一共注意：螺丝一共4个，必须全部取出，否则机壳与电机共振个，必须全部取出，否则机壳与电机共振背面图工作站泵控0.02吋管接进样器或梯度混合器吋管接进样器或梯度混合器ID1/16管抽液管抽液270泵安装请上紧，否则气泡吸入，流动相倒流请上紧，否则气泡吸入，流动相倒流0.04吋管3725进样器安装1、4口接10ml定量环5、6口接废液管2、3口，0.04吋毛细管套不锈钢接头，下部再套Peek转接头，无死体积连接至进样器。将定量环垂直桌面，进样器上架固定。3725进样器3725进样器塔板数是反映色谱柱及仪器性能状态的关键参数塔板数是反映色谱柱及仪器性能状态的关键参数A A12,00012,000相同色谱柱相同色谱柱仪器仪器A：谱带展宽较小（谱带展宽较小（70L）测出的塔板数较高（）测出的塔板数较高（12,000）仪器仪器B：谱带展宽较大（谱带展宽较大（130L）测出的塔板数较低（）测出的塔板数较低（7,000）塔板数：柱效测定结果塔板数：柱效测定结果70007000谱带展宽谱带展宽连接适当连接不妥由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题色谱柱安装及连接的机械因素连接不妥，造成漏液色谱柱安装及连接的机械因素0.0090.0090.0200.0200.0400.040 连接管线的内经对系统谱带展宽的影响 注：过长的管线亦会造成较大的谱带展宽样品谱带在管线内发生了扩散色谱柱安装及连接的机械因素菜单菜单1次、次、2次次停泵、停遥控停泵、停遥控泵参数设置泵参数设置1.开机自检后呈现主画面，可调节F、Max p2.按菜单1次，可调节F、Max p、Min p3.按菜单第2次，可调节内控与遥控、压缩补偿、流速误差、压力单位选择 用键更换子菜单，在闪烁光标处填入数值，按确认用键更换子菜单，在闪烁光标处填入数值，按确认开机主画面开机自检开机主画面开机自检开机主画面用键切换用键切换F、P max设置设置菜单1设置流量设置流量设置Pmax设置设置Pmin设置用键切换用键切换F、P max P min设置设置菜单2设置用键切换用键切换内控与遥控、压缩补偿、流速误差、压力单位选择填入数值内控与遥控、压缩补偿、流速误差、压力单位选择填入数值工作站控制1.设定Pmax。按 菜单键2次（菜单2）选2（EXT），外控灯亮。2.按以下图示操作，设置梯度与选择泵控类型，泵开始输液，运行灯亮。3.一旦启动，可在梯度表中改流量。4.按“启动/停止”键（停流），再按恢复5.脱离外控：按“启动/停止”键（停流），菜单2选1（INT）方法方法1.梯度控制梯度控制2.选择泵类型选择泵类型S系统测试1.进样器末端加堵头，启动泵，使压力升至20MPa 时自动停泵，正常状态二十秒钟以后压力显示能缓慢下降。2.用量筒或移液管检测泵的流量重复性。3.标样测试4.梯度性能测试标样测试 色谱柱：Hypersil C18 10m（20250mm）流速：16.0 ml/min 流动相：甲醇:水85:15（v/v）标样10-4：1.尿嘧啶；2.硝基苯；3.萘；4.芴 进样量：20ul 检测波长：254nm 检测器出口管套废液管，在废液管头部用密封膜封住，防漏液，尾部接1cm，0.009吋毛细管以增加背压。标样测试 色谱柱：SinoChrom 300A ODS-AP 10m（30250mm）流速：30 ml/min 流动相：甲醇:水85:15（v/v）标样10-3：1.尿嘧啶；2.硝基苯；3.萘；进样量：2ml 检测波长：254nm 检测器出口管套废液管，在废液管头部用密封膜封住，防漏液，尾部接1cm，0.009吋毛细管以增加背压。梯度性能检查：1.流动相：1.A：纯水2.B 500mL纯水加入0.5mL 丙酮，超声脱气。2.在进样阀出口与检测器入口间接一根D1.6xID1.0mm 长度为250mm 不锈钢管。3.设定检测波长为254nm。4.设定总流量为20.0mL/min，A、B 泵各为50%冲洗直到基线平稳。5.设定梯度曲线台阶梯度曲线运行台阶梯度曲线前，A、B泵各50运行10分钟，然后A泵100，B泵0运行10分钟，以保证A、B泵中的流动相已经得到充分的置换；台阶梯度计算20%40%60%80%时梯度准确度平均值(真值-实测值)/真值)*100%)/41%注：真值：设定值，实测值：（Vi-Va/(Vb-Va)VbVaVi安装注意1.P230p通常用作半制备系统，流动相必须处于高位。2.制备系统，进样器后连接管路0.02-0.04吋.管道连接必须无死体积3.为防止梯度运行时产生气泡，流动池出口塑料废液末端加塞1cm0.01吋毛细管。4.制备柱柱效测试通常使用最佳理想条件，即需要将进样器3725改为7725，本课重点 制备方法开发步骤 制备放大公式 泵控设置步骤 20mm、30mm柱测试条件 使用注意