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第二十章　弧菌科及检验

本章考点：
　　1.概述
　　2.弧菌属：分类、生物学性状、临床意义、微生物检测方法
　　3.气单胞菌属
　　4.邻单胞菌属

　　弧菌科共同特点是一群氧化酶阳性、具有极端鞭毛、动力阳性、发酵葡萄糖的革兰阴性直或微弯的杆菌。
　　弧菌科包括4个菌属，即弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属和发光杆菌属。前三属细菌均可引起人类感染，发光杆菌属对人无致病性。

　　一、弧菌属
　　弧菌属的细菌分布广泛，以水中最多。
　　世界卫生组织腹泻病控制中心根据细菌的抗原性、生化特性、DNA同源性、致病性和耐盐性等将弧菌分为四类：
　　①O1群霍乱弧菌；
　　②不典型01群霍乱弧菌；
　　③非01群霍乱弧菌；
　　④其他弧菌（副溶血性弧菌）。
　　对人类致病的主要有霍乱弧菌和副溶血性弧菌，分别引起霍乱和食物中毒。
　　（一）霍乱弧菌
　　霍乱弧菌是霍乱的病原菌，该病为一种急性烈性肠道传染病，发病急，传染性强，死亡率高。

　　1.生物学特性
　　（1）形态染色：本菌呈弧形或逗点状，无芽胞，有菌毛，有些菌株有荚膜。一端有一根粗而长的鞭毛，运动活泼。取患者米泔水样粪便作悬滴观察，可见该菌呈穿梭样或流星状运动。液体培养物滴片染色镜检，可见排列如“鱼群状”革兰阴性弧菌。
　　（2）培养特性：需氧或兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好。耐碱不耐酸。可在无盐环境生长。
　　碱性蛋白胨水中，经35℃培养6～9h，在液体表面大量繁殖形成菌膜，可达快速增菌的目的。碱性琼脂平板上，经培养18～24h，形成较大、圆形、扁平、无色透明或半透明似水滴状菌落。
　　硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS）上，形成较大黄色菌落。
　　含亚碲酸钾琼脂平板上，因还原亚碲酸钾成金属碲，使菌落中心呈灰褐色。
　　庆大霉素琼脂上形成的菌落中心呈灰褐色。
　　（3）生化反应：能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，产酸不产气。迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖。氧化酶、明胶酶试验和ONPG试验均阳性。能产生靛基质，霍乱红反应（即亚硝基靛基质试验）阳性。
　　（4）抗原结构与分型：霍乱弧菌具有耐热的特异性0抗原和不耐热的非特异性H抗原。H抗原为弧菌属所共有，特异性低。O抗原特异性高，具有群特异性和型特异性，是分群和分型的基础。

　　（5）变异性：有形态变异、菌落变异、溶血性变异和毒力变异。
　　（6）抵抗力：本属菌对热、干燥、日光、酸、消毒剂很敏感。但耐碱力较强。

　　本章练习题：
　　关于霍乱弧菌，下列哪些说法是正确的
　　A.O1群有古典生物型和EI-Tor生物型之分
　　B.多粘菌素B敏感试验可用于古典生物型和El-Tor生物型的鉴别
　　C.部分菌对庆大霉素敏感
　　D.营养要求高，在普通营养琼脂上生长不好
　　E.感染途径主要是通过污染的水源或食物经口摄入
　　[答疑编号500735200101]
　　『正确答案』ABE
　　2.微生物学检验
　　（1）标本采集：标本以粪便为主，尽可能在患者用药之前采取。可用无菌棉拭子采取自然排出的新鲜粪便，亦可用直肠拭子由肛门插入直肠3～5cm处采集。一般米泔水样便采取1～3ml，成形便采取蚕豆大小。
　　采集的标本应及时接种适宜培养基。不能及时接种者，要接种于保存或运送培养基内尽快送检。常用的保存或运送培养基有碱性蛋白胨水、文-腊二氏保存液和卡-布运送培养基等。
　　（2）检验方法及鉴定

表5-20-1霍乱弧菌两个生物型的鉴别
　　性状　　　　　　　　　　　古典型　　　　　　　　　EITor型
　　溶血（羊红细胞）　　　 　　　-　　　　　　　　　　　　D
　　血凝（鸡红细胞）　　　　　　 -　　　　　　　　　　　　+
　　VIP试验 　　　　　　　　　　 -　　　　　　　　　　　　+
　多粘菌素B敏感试验　　　　　　+　　　　　　　　　　　　-
　噬菌体IV组裂解　　　　　　　+　　　　　　　　　　　　-
　　噬菌体V组裂解　　　　　　　　-　　　　　　　　　　　　+

　　3.临床意义
　　致病物质：霍乱肠毒素，鞭毛，菌毛等。
　　所致疾病：霍乱。表现为剧烈的腹泻和呕吐，导致严重脱水、代谢性酸中毒、休克和死亡。
　　免疫性：霍乱病后可获得牢固的免疫力，再感染者少见。小肠内有sIgA形成。
　　（二）0139型霍乱弧菌
　　属非01群霍乱弧菌，可与0139抗血清凝集。
　　治疗原则：输液，纠正电解质紊乱，选用合适的抗菌药物。
　　（三）副溶血性弧菌
　　副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌。常存在于近海岸海水、海产品及盐渍食品中。它是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。
　　食未煮熟的海产品后发生暴发性食物中毒最可能由哪种细菌引起
　　A.鼠伤寒沙门菌
　　B.痢疾志贺菌
　　C.副溶血弧菌
　　D.霍乱弧菌
　　E.胎儿弯曲菌
　　[答疑编号500735200102]
　　『正确答案』C
　　1.生物学特性
　　（1）形态染色：革兰阴性菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态。两极浓染。菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽胞、无荚膜。
　　（2）培养特性：需氧，营养要求不高，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长。NaCl最适浓度为35g／L，在无盐培养基中不生长。本菌不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂抵抗力弱。生长所需pH为7.0～9.5，最适pH为7.7。
　　在液体培养基表面形成菌膜。
　　在35g／LNaCl琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明；
　　在副溶血性弧菌专用选择培养基上形成1～2.5mm，稍隆起、混浊、无粘性、绿色菌落；
　　在SS平板上不生长或长出1～2mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状。
　　在羊血琼脂平板上，形成2～3mm、圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株可形成β溶血或α溶血。
在TCBS琼脂上不发酵蔗糖，菌落绿色。（与霍乱弧菌相区别）
　　（3）生化反应：本菌在30g／L NaCl和 70g／LNaCl培养基中生长，在无盐或100g／L NaCl培养基中不生长。神奈川试验是致病菌株能使人或兔红细胞发生溶血，对马红细胞不溶血，称神奈川试验阳性。
　　2.微生物学检验
　　1）标本采集：主要是患者的粪便、可疑食物、炊事用具的洗涤液等。
　　2）检验方法及鉴定：①增菌培养：取标本0.5～1ml接种40g／L NaCl蛋白胨水中，37℃培养，若有本菌存在，一般数小时即出现明显混浊，即可分离培养；②分离培养：将标本或增菌培养物接种副溶血弧菌选择培养基35℃培养18～24h观察结果。菌落湿润、混浊无粘性，呈绿色；③鉴定：根据其形态、染色、多形性、活泼动力等特点，以及在选择培养基上的菌落特征，结合氧化酶试验阳性，在KIA上K/A， H2S（-）。在MIU上“ ++-”。以及嗜盐试验和血清学分型可作初步鉴定。
　　最后鉴定，必要时作进一步生化试验及毒力试验。
　　3.临床意义：致病因子有粘附因子（主要为菌毛）、毒素（如耐热性溶血素）。
　　所致疾病为食物中毒及急性胃肠炎，常为被污染的海产品及盐腌制品所引起，此菌尚可引起浅表创伤感染、败血症等。
　　 4.治疗原则：选用合适的抗生素及其他抗菌药物，严重病例需输液及补充电解质。

　　二、气单胞菌属与邻单胞菌属
　　（一）气单胞菌属
　　气单胞菌属广泛分布于自然界，可从水源、土壤以及人的粪便中分离。本属细菌有的种可引起人类腹泻等多种感染。
　　1.生物学特性
　　（1）形态染色：革兰阴性短杆菌，大小为（1～4）μm×（0.1～1）／μm，菌体两端钝圆，单极鞭毛，运动极为活泼（除杀鲑气单胞菌外）。无芽胞，有窄的荚膜。
　　（2）培养特性：需氧或兼性厌氧。最适生长温度30℃，但在0～45℃皆可生长。营养要求不高，在普通培养基上35℃经24～48h形成1～3mm大小，微白色半透明的菌落；在血琼脂上形成灰白、光滑、湿润、凸起直径约2mm的菌落，多数菌株有β溶血环，3～5天后菌落呈暗绿色；在肠道选择培养基上，大多数菌株形成乳糖不发酵菌落；在TCBS琼脂上生长不良；液体培养基中呈均匀混浊。
　　（3）生化反应：发酵葡萄糖产酸，氧化酶和触酶试验阳性，在65g／L NaCl中不生长。
　　2.微生物学检验
　　（1）标本采集：根据不同疾病采集粪便或肛拭子、血液、脓汁、脑脊液、尿液等标本。
　　（2）检验方法及鉴定：
　　1）直接涂片：标本涂片革兰染色镜检，呈革兰阴性短杆菌。悬滴标本观察动力，运动活泼。
　　2）分离培养：血液标本经肉浸液或胰化酪蛋白大豆肉汤内增菌后转种血琼脂平板或含氨苄青霉素血平板；脓汁、分泌物等直接接种血琼脂平板；粪便标本接种肠道选择培养基。另一部分标本可接种于PBS，置4℃冷增菌后，于1、3、5、7、17天移种分离平板上。标本接种后，经37℃培养24～48h，观察菌落。
　　3）鉴定：①初步鉴定：挑可疑菌落移种KIA、MIU做初步生化反应，KIA：K／A、产气+／-、H 2S-，MIU：++-；氧化酶阳性；②最后鉴定：氧化酶试验阳性可与肠杆菌科细菌鉴别，发酵葡萄糖可与非发酵菌鉴别；
　　（二）邻单胞菌属
　　邻单胞菌属只有一个种即类志贺邻单胞菌。存在于水、鱼、动物和人类肠道。能引起人类水样腹泻和食物中毒，在机体免疫力降低时，可引起蜂窝织炎、骨髓炎、脑膜炎和败血症。与志贺菌属的鉴别：氧化酶和动力试验，邻单胞菌均为阳性，志贺菌属均为阴性。
　　（三）临床意义
　　气单胞菌可引起腹泻，并可引起伤口感染及菌血症，偶尔引起心内膜炎、脑膜炎、肺炎、脊髓炎、腹膜炎、关节炎、血栓性静脉炎和胆囊炎。邻单胞菌属中类志贺邻单胞菌引起水样腹泻，亦可引起菌血症可伴有脑膜炎。
　　（四）治疗原则
　　选用合适的抗菌药物，如严重腹泻（如霍乱样腹泻），应输液及纠正电解质紊乱。
　　关于霍乱，下列哪项是错误的
　　A.为烈性传染病
　　B.经口传播
　　C.病后可获得免疫力
　　D.人类是霍乱弧菌的唯一易感者
　　E.人类对霍乱的免疫力主a要靠sIgA
　　[答疑编号500735200103]
　　『正确答案』D
第二十一章　弯曲菌属和幽门螺杆菌及检验

本章考点：
　　1.概述：概念
　　2.弯曲菌属，幽门螺杆菌
　　分类，生物学性状，临床意义，微生物学检查

　　一、弯曲菌属
　　（一）概述：
　　弯曲菌属细菌是一类微需氧，不分解糖类，氧化酶阳性，菌体弯曲呈逗点状、S形或螺旋状，有动力的革兰阴性菌。包括5个种和5个亚种。对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种。前者是人类腹泻最常见的病原菌之一，后者在免疫功能低下时可引起败血症、脑膜炎等。
　　（二）生物学性状
　　1.形态染色：革兰阴性、细长、螺旋形或海鸥展翅状、Ｓ形的弯曲杆菌。一端或两端具有单鞭毛，运动活泼，有时呈螺旋状运动。一端单鞭毛多见于胎儿亚种，两端单鞭毛多见于空肠弯曲菌，无芽胞，无荚膜。
　　2.培养特性：微需氧菌，初次分离时需在含5%O2、85%N2、10%CO2气体环境中生长，传代培养时能在10%CO2环境中生长。

本属菌最适生长温度随菌种而异（生长温度差异可作为菌种鉴别要点）。
　　菌种
　　25℃
　　37℃
　　42℃
　　大肠弯曲菌
　　　-
　　　+
　　　+
　　空肠弯曲菌
　　　-
　　　+
　　　+
　　简明弯曲菌
　　　-
　　　+
　　　-
　　胎儿弯曲菌
　　　+
　　　+
　　　-

　　营养要求高，在普通培养基上不生长。需加入血液、血清才能生长。常用的选择培养基有Skirrow琼脂和Campy-BAP培养基。这些培养基以血琼脂为基础，加人多种抗生素，能抑制肠道正常菌群，而有利于本菌的分离。空肠弯曲菌初次分离时，经48h培养可形成两种菌落；一种为扁平、湿润、灰白色、半透明、边缘不整齐、常沿接种线扩散生长的菌落；另一种为圆形、凸起、半透明、针尖状、有光泽、单个细小菌落。两种菌落均不溶血。在布氏肉汤内呈均匀混浊生长。
　　3.生化反应：本属细菌生化反应不活泼。不分解糖类、不液化明胶、不分解尿素，V-P和甲基红试验均阴性。氧化酶均为阳性，大多数弯曲菌能还原硝酸盐、触酶试验为阳性，空肠弯曲菌马尿酸水解试验阳性。
　　4.抗原结构：有菌体（O）抗原、热不稳定抗原和鞭毛（H）抗原。根据O抗原可将空肠弯曲菌分为42个血清型。
　　5.抵抗力：抵抗力较弱，56℃5分钟即被杀死。干燥环境中仅能存活3小时。
　　（二）微生物学检验
　　1.标本采集：立即送检，及时接种。
　　2.检验方法及鉴定
　　（1）直接涂片
　　1）悬滴标本检查：显微镜下观察有无投镖式或螺旋状运动的细菌。
　　2）革兰染色检查：为革兰阴性逗点状、S形或螺旋状小杆菌。
　　（2）分离培养：粪便和肛拭子标本直接接种于改良弯曲菌琼脂平板如改良的Skir-row血琼脂平板和Campy-BAP平板；血液或脑脊液标本接种布氏肉汤增菌后，转种弯曲菌分离培养基，置42℃、37℃，在微需氧环境下培养24～72h，观察菌落特征。
　　（3）鉴定
　　革兰阴性细小弯曲杆菌，单鞭毛具有投镖样或螺旋样动力，需氧环境不生长，微需氧条件下，在弯曲菌选择培养基上形成两种类型菌落。不分解葡萄糖。弯曲菌属的鉴定要点为氧化酶阳性，革兰阴性，菌体弯曲或呈S形。最常用的鉴定试验有生长温度（25℃、37℃、42℃）试验、过氧化氢酶试验、马尿酸盐水解试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验、硫化氢试验等。
　　（三）临床意义
　　致病因素主要与肠毒素、细胞毒素、内毒素和黏附、定植能力有关。主要引起人类肠道感染和各种肠道外感染。其中空肠弯曲菌是引起散发性细菌性肠炎最常见的菌种之一。胎儿弯曲菌主要引起肠道外感染，其中胎儿亚种为主要的人类致病菌，致菌血症、胆囊炎、腹膜炎、肺部感染等。
　　（四）治疗原则
　　空肠弯曲菌常对红霉素、克林霉素和四环素敏感，多数空肠弯曲菌对氨基糖苷类、氯霉素及氟喹诺酮类敏感，由于可产生β-内酰胺酶，一般对β-内酰胺类耐药。
　　关于弯曲菌的描述，正确的是
　　A.微需氧菌
　　B.革兰阴性，呈细长、螺旋形、海鸥展翅状或S形
　　C.营养要求高，培养基中需加入血液、血清才能生长
　　D.生化反应活泼
　　E.对人致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌
　　[答疑编号500735210101]
　　『正确答案』ABCE

　　二、幽门螺杆菌
　　（一）简述
　　幽门螺杆菌是一类氧化酶和过氧化氢酶均阳性、微需氧、在37℃能够生长，在25℃不能生长42℃少数生长的革兰阴性弯曲的细菌，有动力。能引起人类疾病的有3个种，即幽门螺杆菌（H.pylori）、H.fennelliae和H.cinaedi。幽门螺杆菌多见。
　　（二）生物学性状
　　革兰阴性，菌体细长弯曲呈螺旋形、S形或海鸥状。
　　菌体一端或两端可有多根带鞘鞭毛。运动活泼。
　　微需氧，在5%O2、85%N2、10%C02的环境中生长良好。
　　对湿度要求较高，相对湿度最好在98%以上。
　　对营养要求较高，一般需含血或血清才生长。为抑制杂菌培养基中添加多粘菌素B、万古霉素、两性霉素、TMP等。
　　HP与其他细菌相比有一定的耐酸性，但对酸仍比较敏感，pH降至3.5以下活力明显减弱。
　　生化反应不活泼。氧化酶、触酶、DNA酶均阳性。快速脲酶试验强阳性（该菌能产生丰富的尿素酶是其显著的特征）。
　　（三）临床意义
　　全球一半以上人口被HP感染。传播途径推测经口感染，HP感染与消化性溃疡，十二指肠溃疡有密切关系。HP存在于胃黏膜上皮表面和粘液底层，胃窦为定植的最佳部位，HP数量较多，胃体和胃底较少。
　　（四）微生物检查
　　1.标本采集：从多部位采集胃黏膜活检标本，放入20%葡萄糖运送液或无菌生理盐水中立即送检，4℃冰箱保存，不超过5小时。
　　2.检验方法
　　（1）快速诊断：有直接染色镜检，快速脲酶分解试验、碳标记（13Ｃ或14Ｃ标记尿素）呼气试验（如果C02超标，提示HP存在）、有商品试剂盒检测粪便HP抗原、血清学检测抗Hp菌体抗体或脲酶抗体、基因芯片法检测脲酶、细胞毒素和空泡毒素抗体。分子生物学技术检测毒素基因。
　　（2）分离培养鉴定：用选择性培养基（如血巧克力培养基中添加多粘菌素、万古霉素、两性霉素、TMP等）和非选择性培养基放在微需氧和湿润的环境中，35℃孵育3～4天，挑选出细小、针尖大小、半透明的、不溶血的可疑菌落，做生化鉴定。
　　（3）药敏试验：测试MIC
　　（4）治疗：选用一种质子泵抑制剂（PPI）或一种胶体铋剂加上克拉霉素、阿莫西林（或四环素）甲硝唑（或替硝唑），3种抗菌药物中的2种，组成三联疗法。也可用PPI、胶体铋剂联合两种抗生素的四联疗法。
　　关于幽门螺杆菌的生物学性状，叙述正确的是
　　A.菌落细小、半透明、不溶血
　　B.兼性厌氧生长
　　C.氧化酶阳性
　　D.革兰阴性螺旋形
　　E.快速脲酶试验强阳性
　　[答疑编号500735210102]
　　『正确答案』ACDE