T_CVDA 2-2022 动物新型冠状病毒中和抗体检测技术.docx
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1、ICS 11.220B 41T/CVDA团 体 标 准T/CVDA 2-2022 动物新型冠状病毒中和抗体检测技术Detecting technique of neutralization antibody against SARS-CoV-2 in animals 2022 - 07 - 19 发布2022 - 07 - 25 实施中国兽药协会发布目 录目 录1 前 言2 1 范围3 2 规范性引用文件3 3 符号和缩略语3 4 试剂和材料3 5 器材和设备4 6 动物血清4 6.1 安全防护4 6.2 血清采集4 7 PRNT 实验操作4 7.1 安全防护4 7.2 材料准备4 7.2.1
2、 病毒繁殖5 7.2.2 毒价测定5 7.2.3 细胞5 7.2.4 血清灭活5 7.3 检测操作5 7.3.1 对照设置5 7.3.2 血清稀释5 7.3.3 病毒与血清中和6 7.3.4 接种细胞6 7.3.5 结果判定6 附录 A7 A.1 培养液7 A.2 稀释液7 A.3 细胞分散液7 A. 4 磷酸盐缓冲液(PBS)7 附录 B8 B. 1 材料和试剂8 B.2 方法8 B.2.1 嵌合 SARS-CoV-2 S 蛋白重组水泡性口炎病毒的构建与拯救8 B.2.2 重组病毒的传代与毒价测定9 B.2.3 重组病毒的鉴定9 B.2.4 rVSVG-nCoVS-EGFP 为抗原的中和实验
3、的回归分析9 动物新型冠状病毒中和抗体检测技术1 范围本标准规定了用于动物新型冠状病毒血清中和抗体测定的实验操作方法及结果判定标准。本标准适用于动物血清中新型冠状病毒中和抗体的定性检测和定量测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB /T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则。GB/T 6682 2008 分析实验室用水规格和试验方法。GB 19489 2008 实验室 生物安全通用要求。3 符号和缩略语下列符号和缩略语
4、适用于本标准。SARS-CoV-2:新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2); Vero E6:非洲绿猴肾细胞(African green monkey kidney cell); rVSVG-nCoVS-EGFP:表达绿色荧光蛋白的新型冠状病毒纤突蛋白S 嵌合水泡性口炎病毒;TCID50:半数组织培养感染量(Tissue Culture Infective Dose); BSL-2:生物安全2级实验室(Biosafety Laboratory Level-2); BSL-3:生物安全3级实验室(Biosafety Labo
5、ratory Level-3); PRNT:噬斑减少中和试验(plaque-reduction neutralization test);DMEM:Dulbecco 改良的Eagle培养基(Dulbeccos Modified Eagles Medium); PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline);PFU:噬斑形成单位(Plaque Forming Unit); FFU:荧光灶单位(Fluorescence Focus Units); FBS:胎牛血清(Fetal Bovine Serum)。4 试剂和材料除非另有规定,仅使用分析纯试剂。4.1 水:GB/T
6、 6682-2008,二级水。4.2 新型冠状病毒抗体阴性血清,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备、鉴定并保存。4.3 新型冠状病毒抗体阳性血清,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备、鉴定并保存。4.5 含2% FBS的DMEM液培养基(见A.2)。4.6 细胞分散液(0.25%胰酶)(见A.3)。4.7 磷酸盐缓冲液(PBS)(见A.4)。4.8 Vero E6细胞。4.9 rVSVG-nCoVS-EGFP病毒。4.10 胎牛血清(FBS)。4.11 青-链霉素溶液。5 器材和设备5.1移液器,50 L300 L(2%)。5.2 96孔细胞培养板。5.3 37,5%二氧化碳培养箱。5.4
7、倒置显微镜。5.5 普通冰箱和超低温冰箱。5.6 细胞计数器。5.7 20 L200 L 吸头。5.8 BSL-2级生物安全柜。5.9 倒置荧光显微镜。6 动物血清6.1 安全防护进行血液样本采集的人员应采取佩戴口罩、手套,着长袖工作服等防护措施。6.2 血清采集无菌采集动物血液,室温或37静置60 min。4放置1 h至过夜后,6000 r/min离心5 min,收集上清,-20以下保存待检。样品采集应详细记录动物品系、年龄、免疫史、时间、地点、主人姓名与联系方式等信息。7 PRNT 实验操作7.1 安全防护本检测应在满足GB19489-2008 的 BSL-2 级生物安全实验室内进行。进行
8、本检测的人员应采取佩戴口罩、手套,着长袖工作服等防护措施。7.2 材料准备7.2.1 病毒繁殖将 rVSVG-nCoVS-EGFP 接种于 Vero E6 单层细胞,37吸附 1h 后加入维持液,置 5%二氧化碳(CO2)培养箱培养,逐日观察。培养 48h 或待绿色荧光扩散达 90%以上,收获病毒上清,分装成 1mL/瓶,置-70保存备用。7.2.2 毒价测定将收获的病毒悬液在 96 孔板上做 10-110-8 稀释,每个稀释度作 8 孔,每孔加入病毒悬液 50L,加入细胞悬液 100 L(每毫升含 310 5 个细胞),每块 96 孔板设 8 孔细胞对照。置 5%CO2 培养箱 37培养,培
9、养 48h 后观察绿色荧光并记录。按 Reed-Muench 方法计算出病毒悬液的毒价(TCID50/50L)。7.2.3 细胞按常规方法用含 10%FBS 的 DMEM 液培养Vero E6 细胞,1 个 75 cm2 的细胞培养瓶(20 mL 培养液)细胞培养 48 h 后,可以用于 4 块 96 孔(每孔细胞数约为 310 4 细胞/孔)细胞培养板的检测。7.2.4 血清灭活阳性血清、阴性血清、待测血清在 56下灭活 30 min。灭活时,将血清样本放在 56恒温水浴箱内,水面要高于血清液面,但不要超过样品管高度。7.3 检测操作7.3.1 对照设置细胞对照:设 4 孔正常细胞对照,即每
10、孔加细胞悬液 100L(每毫升 310 5 个细胞)。阴性血清对照:设 4 孔阴性对照,每孔加阴性血清和 100TCID50/50L 病毒悬液各 50L,再加入细胞悬液 100L(每毫升含 310 5 个细胞)。病毒回归对照:将病毒用稀释液稀释成 100、10、1、0.1TCID50/50L,每个稀释度作 4 孔,每孔加入 50 L 病毒悬液,每孔补充稀释液 50 L,再加入细胞悬液 100 L(每毫升含 310 5 个细胞)。阳性对照血清:将阳性血清作 1:4、1:8、1:16、1:32、1:64 稀释,每个稀释度作 4 孔,每孔加各稀释度阳性血清和 100TCID50/50L 病毒悬液各
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