小叶榕浸膏生产工艺研究.doc

目 录

[摘 要] 1
[关键词] 1
引言 1
1.实验材料和方法 1
1.1 材料与试剂 1
1.2 实验方法 2
2 实验及结果 2
2. 1 溶液的配制 2
2. 2 测定波长的确定与标准曲线 2
2.3 总黄酮含量测定 3
2.4 初步实验操作及结果分析 3
2.4.1药材提取时间的选择 3
2.4.2 提取加水量研究 3
2.5 正交实验的结果 4
2.6 70%乙醇提取工艺的研究 7
2.7 水提取甲壳素沉淀除杂法工艺研究 7
3 实验结果与讨论 7
4.结论 8
[参考文献] 8
致 谢 9
声 明 10

小叶榕浸膏生产工艺研究

[摘 要] 目的 研究小叶榕浸膏生产的最佳工艺条件。方法 通过初步实验和正交实验，以总黄酮含量为指标，对小叶榕浸膏生产过程中的关键要素进行优选。结果 所考查的因素中，小叶榕浸膏提取工艺各因数影响程度为：醇沉时溶液相对密度>加水量>提取时间；最佳搭配为：A2B3C1。结论 小叶榕浸膏生产的最佳工艺条件为：加水量27（19+8），、提取时间4（3+1）小时，醇沉时溶液相对密度1.18/80℃。
[关键词]小叶榕浸膏；总黄酮；正交实验；工艺研究
引言
小叶榕为桑科植物榕树Ficus microcarpa L.f.,入药主用其叶。研究表明，小叶榕叶主要含有黄酮、三萜类等化合物。其药用成份对治疗心血管疾病、抗炎、抑菌等方面都有显著疗效。在两广民间广泛将其用于咳嗽、哮喘、支气管炎等多种疾病的治疗[1，2]。以小叶榕浸膏为主要原料的产品—咳特灵片、咳特灵胶囊，由于疗效确切已被中华人民共和国卫生部药品标准所收载[3]，目前全国生产企业达210家以上[4]。
目前浸膏的法定生产工艺为：水提—浓缩—乙醇沉淀。由于现行法定标准对生产工艺规定不够严格，浸膏生产的三大主要因素：药材提取时的加水量、提取时间、醇沉时溶液的相对密度等没有明确规定，造成各企业浸膏质量水平参差不齐。虽然，近年来一些单位对浸膏的生产工艺做过研究，但结果有矛盾之处[5，6]，而以法定生产方法为依据的浸膏生产工艺研究未见报道（CNKI数据库）。故本课题以浸膏总黄酮含量为指标，对前述3个主要因素开展初步实验和正交实验，以寻求法定标准条件下的最佳提取工艺。另外，还以总黄酮类成分含量为指标，采用70%酒精直接提取，水提取甲壳素沉淀两种不同的生产工艺，对浸膏的生产方法进行研究对比，以寻求有效成分收得率更高、更经济的生产工艺。
1实验材料和方法
1.1 材料与试剂
小叶榕药材：采集广西天等县，经植物园胡廷松教授鉴定为桑科植物榕树Ficus microcarpa L.f.干燥叶。芦丁对照品：中国药品生物制品检定所，批号：100080-200306。小叶榕标准对照药材：中国药品生物制品检定所，批号：121280-200503。乙醇、甲醇、苯、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。
WFZUV-2102 型紫外分光光度计(上海优尼柯仪器有限公司)、真空干燥箱、1/10万分析天平（GR-202，A&D日本）、ZF—I型三用紫外分析仪等。
1.2 实验方法
1.2.1工艺流程
加水定量 过滤、蒸发浓缩 酒精调含酒量80%
榕树叶 水提取液 浓缩液
定时提取 定相对密度/温度 静置、过滤
蒸发浓缩、干燥
滤液 最佳提取工艺
总黄酮含量测定、分析
1.2.2实验步骤
初步实验：通过对相同产地、批次药材4个不同提取时间、4个不同加水量、5个不同酒沉相对密度的初步研究，确定浸膏提取比较优化的提取条件。
正交实验：以浸膏提取比较优化的提取条件，开展3因素3水平的实验研究，通过L9（34）正交表的分析，探索出最佳提取方案。
2 实验及结果
2. 1 溶液的配制
精密称取干燥恒重芦丁0.0205g，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.205mg /l对照品溶液。
精密称取隆安小叶榕浸膏0.082g，加甲醇45ml；回流提取1h，放冷、滤纸过滤到50ml量瓶中，用少量甲醇洗涤残渣，洗涤液过滤并入量瓶中，加甲醇到刻度，摇匀为供试小叶榕浸膏浓配液。
精密取上述芦丁对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0、4.0ml、5.0ml与6.0ml，分别置25ml容量瓶中，各加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6钟，加氢氧化钠试液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，作为芦丁供试液。
精密量取小叶榕浸膏浓配液5ml分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6钟，加氢氧化钠试液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，作为浸膏供试液。
2. 2 测定波长的确定与标准曲线
取供试品及4.0ml对照品溶液制成的芦丁供试品溶液和浸膏供试液，在200~700nm波长下扫描，结果两溶液在385nm处有共同的最大吸收峰，故选择385为测定波长。
照分光光度法(中国药典2005年版一部附录ÍA ) 在385nm 波长处测定以上芦丁供试液的吸收度，结果见下表。以吸收度为纵坐标, 浓度为横坐标进行线性回归， 得回归方程为: Y=18.31X﹢0.008 r=0.9992。线性范围8.2µg～49.2µg/ml。
2.3 总黄酮含量测定
分别取干浸膏细粉适量，置回流容器中，加甲醇加热回流，滤过，滤液转移至50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6钟，加氢氧化钠试液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的溶液为空白。照分光光度法（中国药典2005年版一部附录V A），在385nm 测定吸收度，按Y= 18.31X+ 0.008 （Y为吸收度，X为浓度，单位为：mg/ml）计算各方法所得干浸膏量和总黄酮量。
2.4 初步实验操作及结果分析
2.4.1药材提取时间的选择
取4份50g小叶榕干药材,，统一按首次提取加水20 倍，2次提取 10 倍，分别按煮沸时间不同的方法提取两次，提取液滤布滤出准确计量后，分别从中精密吸取50ml，用恒重过的蒸发皿蒸干、100℃恒重，折算干浸膏收率。取药渣统一加水500 ml（浸没为准）煎煮30分钟，煎煮液统一浓缩到 50 ml，做盐酸-镁粉反应，结果见下表1所示：
由表1可见，第四组提取效果最好，第一组最低，而且药渣提取液与盐酸镁粉反应呈阳性，说明干膏收率随着药材提取时间的增加而增加，但综合能耗等因素考虑，生产上选择第一次提取3小时，第二次提取1.5小时为好。
表1药材不同提取时间的测定结果

项目
1
2
3
4
1/0.5
2/1
3/1.5
4/2
干膏率（%）
7.2
11.22
12.41
13.09
盐酸镁粉反应
+
-
-
-

2.4.2 提取加水量研究
取4份50g小叶榕干药材，分别按1次、2次提取加水不同倍数，统一按首次提取 3 小时、2次提取 1.5 小时的方法提取。提取液滤布滤出准确计量后，分别从中精密吸取50ml，用100℃恒重过的蒸发皿蒸干、100℃恒重，折算干浸膏收率。取药渣统一加水500ml煎煮30分钟，煎煮液统一浓缩到50ml，做盐酸-镁粉反应，结果见下表2所示：
表2药材不同提取加水量的测定结果

项目
1
2
3
4
15/8
18/10
21/12
24/14
干膏率（%）
13.03
13.86
12.78
13.99
盐酸镁粉反应
-
-
-
-
由表2可知，随着加水量的增加干膏率也增加，但第三组反而下降了，可能是实验中的误差造成的。但综合能耗等因素考虑，生产上选择首次加水18倍，2次加水10倍提取为好。
2.4.3提取浓缩液酒精沉淀时相对密度研究
精密量取5份50ml小叶榕提取浓缩液（广西药用植物园药材提取），加水分别调节各溶液不同的相对密度，每份加酒精调节到含醇量为80%、搅匀、精确测定体积、放置分层后滤纸过滤，分别收集续滤液并精确量取50ml，用100℃恒重过的蒸发皿蒸干、100℃恒重，折算干浸膏量并取适量测定总黄酮含量。结果见表3所示：
表3 提取浓缩液酒精沉淀时相对密度不同对提取结果的影响
序号
调节d值
含酒80%V
50ml干膏量（g）
折算干膏量（g）
折算总黄酮量（g）
1
1.15/80℃
1190ml
0.7199
17.1336
2.1618
2
1.125/80℃
1155ml
0.6240
14.4144
1.5879
3
1.10/80℃
1118ml
0.5222
11.6764
1.4253
4
1.075/80℃
1025ml
0.4252
8.7166
0.9603
5
1.05/80℃
1020ml
0.2290
4.6716
0.6895
由表4可知，浓缩液酒精沉淀时相对密度对小叶榕中黄酮类化合物的收率有较大影响，在相对密度较高的条件下有利于总黄酮的回收，其中酒精沉淀时相对密度为1.15/80℃黄酮收率最高。
2.5 正交实验的结果
在以上初步实验和能耗综合考虑的基础上，制订了以表4的加水量、提取时间、醇沉时溶液相对密度3方面因素的三个不同水平的L9（34）实验设计。
表4 因素水平表
水平
A
B
C
加水量（药材重量倍数）
提取时间（h）
醇沉时溶液的相对密度
1
16 + 10 =26
2 + 1 =3
1.18（称量法、室温）
2
19 + 8 =27
2.5 + 1 =3.5
1.15（称量法、室温）
3
20 + 9=29
3 + 1 = 4
1.12（称量法、室温）
具体实验操作如下：
称取50g药材，按药典方法进行净制后，按不同的加水量和时间,提取两次。用纱布过滤，合并滤液。加热浓缩到20ml左右，用10ml的容量瓶称取重量，以调节相应的相对密度，加水到100ml，加乙醇使含量达80%（酒精计测量），放置分层后滤纸过滤，分别收集续滤液并精确量取50ml，用100℃恒重过的蒸发皿蒸干、100℃恒重，折算干浸膏量并取适量测定总黄酮含量。
结果与极差分析见表5，方差分析见表6。
表5 小叶榕浸膏工艺正交实验设计及结果

因素
评价指标
综合
评分
（%）
A
B
C
D
干膏率
%(g/g)
干膏总黄酮含量%(g/g)
1
1
1
1
1
4.73
11.97
77
2
1
2
2
2
4.30
9.62
65
3
1
3
3
3
4.26
10.76
69.2
4
2
1
2
3
3.98
13.70
78.6
5
2
2
3
1
3.96
12.46
73.7
6
2
3
1
2
5.06
15.61
93.1
7
3
1
3
2
3.97
11.91
71.7
8
3
2
1
3
6.10
12.30
87.2
9
3
3
2
1
5.19
12.46
81.8
K1
211.20
227.30
257.30
232.50

K2
245.40
225.90
225.40
229.80

K3
240.70
244.10
214.60
235.00

R
11.40
6.07
14.23
1.73

Si
229.11
68.38
328.62
4.51

浸膏得率 总黄酮含量
综合评分= ×0.4 ×100% + ×0.6 ×100%
最大浸膏得率 最大总黄酮含量
表6 方差分析表注：
误差来源
SS
f
S
F
P
A
229.11
2
11.55
50.81
<0.05
B
68.38
2
34.19
15.17
>0.05
C
328.62
2
164.35
72.88
<0.05
误差
4.51
2
2.25
1.00

F0.02（2，2）= 19.0
以综合评份为评价指标，由表6中极差值大小显示，各因素作用主次为C>A>B；由表7方差分析结果表明：C因素和A因素的影响具有显著性意义（P<0.05）,B因素无显著性意义（P>0.05），以A2B3C1首次提取加水19倍、二次提取加水8倍，首次提取3h、二次提取1h，酒沉时浓缩液相对密度为1.18/80℃的工艺为最佳。
2.6 70%乙醇提取工艺的研究
取小叶榕药材10g 粉碎成粗粉，加70%酒精回流提取两次，每次120 ml，回流时间为首次 2小时、2次 1小时。提取液过滤（滤布），蒸馏回收酒精，余液蒸干，用100℃恒重过的蒸发皿蒸干、100℃恒重，得干浸膏0.2210g，折算干浸膏收率为2.21%。精密称取0.0205g，按2.34总黄酮含量测定法，计算总黄酮量。
Y385nm =0.541 X=0.0291 被测干浸膏总黄酮量=7.275mg
干浸膏总黄酮含量=7.275/20.5×100%=35.49%
药材总黄酮提出量=35.49%×0.2210g=0.0802g
药材总黄酮收率=0.0802g/10g×100%=0.802%
2.7 水提取甲壳素沉淀除杂法工艺研究
取小叶榕药材10g 粉碎成粗粉，按前述最佳提取工艺进行提取浓缩，浓缩液按2%甲壳素（2%醋酸）溶液：浓缩液=1.5：10的比例进行混合，滤出沉淀，清夜蒸发到小体积，用100℃恒重过的蒸发皿蒸干、100℃恒重，折算干浸膏收率。得干浸膏：0.829g取干浸膏细粉精密称重0.0850g，按2.3.3总黄酮含量测定法，计算总黄酮量。
Y385nm =0.126 X=0.0064 总黄酮提取回收量= 0.0156g
总黄酮提取回收率= 0.156%

3 实验结果与讨论
3.1通过对小叶榕浸膏法定生产工艺的初步研究和正交实验研究，优选提取工艺条件。对浸膏得率、总黄酮含量两个评价指标分别赋予不同的权重，考虑到总黄酮的重要性和生产成本，将浸膏得率的权重定为0.4，浸膏总黄酮含量的权重定为0.6，用综合评分方法优选出的最佳工艺为：首次加水量19倍提取3个小时，第二次加水量8倍提取1个小时，醇沉时溶液相对密度1.18/80℃。
3.2 本课题除艺开展系统研究外，对70%乙醇提取，水提取甲壳素沉淀除杂法等两种浸膏生产工艺也进行了初步研究。其中，70%乙醇提取方法的药材总黄酮收率为0.802%，比水提取酒精沉淀法（药材总黄酮收率0.5%左右）总黄酮收率略高，这与小叶榕醇提物止咳平喘作用稍强于水提物[7]的文献报道相吻合。但此方法没有通过系统的药理学和临床验证，真正运用于生产实践还要做大量工作。
甲壳素是目前在饮料和液体制剂澄清除杂工艺方面广泛使用的天然、安全阳离子型絮凝剂，从原理来看，甲壳素分子中的氨基带正电荷，可与溶液中的胶质、蛋白以及带负性电荷悬浮颗粒生成不溶于水的共聚沉淀物[8]，使其沉淀去除。但在小叶榕药材的分离除杂过程中，可能引起了黄酮类成分的沉淀，总黄酮的收率很低（仅为0.156%），故不应进一步研究。
4.结论
通过初步实验和正交实验，按现行法定生产工艺生产小叶榕浸膏的最佳生产工艺为：首次提取加水19倍、二次提取加水8倍，首次煮沸提取3h、二次提取1h，酒沉时浓缩液相对密度为1.18/80℃。

[参考文献]
[1] 江苏新医学院编．中药大辞典(下册)[M]．上海：上海科技出版社．1988．2529．
[2] 国家中医药局《中华本草》编委会编．中华本草(第二册)[M]．上海：上海科技出版社，1999.495—497．
[3] 中华人民共和国卫生部药政局.中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂.第14册[S]1997：108：110.
[4] 中华人民共和国食品药品监督管理局.基础数据库. .
[5] 詹冬华,郑捷,熊志玲,等. 咳特灵颗粒提取工艺研究[J].中南药学,2005,3(4):225.
[6] 叶荣科,张德志,周宏兵,等.小叶榕树叶总黄酮水提醇沉工艺研究[J].广东药学院学报,2003,19（4）：330.
[7] 韦锦斌,王乃平,臧林泉,等.小叶榕水提物和醇提物止咳平喘作用的比较研究[J].广西中医药,2006, 29（4）：58-59.
[8] 秦腊梅,张壮,郎富和,等. 絮凝剂在中药提取工艺过程中的应用研究[J].中国实验方剂学杂志,2000，6（3）：3-5.

致 谢

在本文定稿之际，谨向三年师专学习期间给予我们无私关心和帮助的化学与工程系的系领导、全体老师和实验室的实验员、老师、同学们致以最诚挚的谢意！
感谢系领导给予我们的热情帮助和指导。
感谢XX老师给予我们良好的机会和条件来完成我们的毕业论文，感谢她在我们实验和写作论文时给予的指导。XX老师是一名拥有渊博的知识，敏锐的科研思维，严谨求实的治学态度，以及宽以待人的高尚品质的教师，她的这些品质都给我们留下了非常深刻的印象，成为我们学习的榜样。
感谢化学系所有实验员在我们做实验时给予的支持和协助。
感谢这三年来所有关心、帮助过我们的老师、同学、朋友。
衷心感谢善良的父母多年来对我们学业的理解和支持，这是我们学习不竭动力的源泉。

9