TargetLynx定量计算和定性分析入门.docx

QmGC培训教材之二
TargetLynx定量计算和定性分析入门

郑传奇
目录

一、TargetLynx能做什么
二、编辑TargetLynx格式的样品表（Sample List ）
三、查看标准样MRM通道
四、建立TargetLynx处理方法
五、样品进行定性和定量
六、查看处理结果

一、TargetLynx能做什么
1. TargetLynx可以用以化合物的定量计算，或通过化合物的离子比率对化合物加以定性。同时 TargetLynx 还可以进行色谱系统适应性的检测，如果适应性指标超出设定的限制范围，将给出相应的标记信息。
2. 由于TargetLynx 是通过某化合物的2个 MRM通道的离子比率对化合物进行定性，因此必须确保每个化合物必须采集至少两个通道 MRM的数据
3. TargetLynx的离子比率定性鉴别同样可以应用于SIR色谱图，采集的数据必需具有一个分子离子峰和源内CID产生的离子碎片通道。
二、编辑TargetLynx格式的样品表（Sample List ）

自定义TargetLynx 数据处理的样品表。
1. 在Sample List 的菜单工具栏，选择Samples – Format – Load；
2. 选择quantify.fmt 格式，并点击OK，将打开一个具有定量计算基本格式的样品表，现在编辑需要的TargetLynx 格式；
3. 右键点击样品表的第一行并选择 或在sample list的编辑窗口中，点击Samples>Customize>Load
4. 在Customize Field Display列表中，选中 ，加入一个浓度栏 。选中 并点击OK；
注: 是用以更新保留时间（retention time） 和离子比率（ion ratios ）。
5. 确认以下的样品信息已经输入到样品表：
a. File name，Sample ID， File Text，Injection Volume，Sample Type，Conc和Quan Ref 显示在样品表页面，MS File，Inlet File和Bottle是否显示不影响计算；
b. 确定样品类型；

c. 在Conc A栏输入组分A的浓度，在Conc B栏输入组分B的浓度，如有更多组分，则依次输入；
d. 在标准样栏输入“ X”用于更新保留时间和离子比率
6. 在菜单栏选 File – Save As 并给样品表命名 (扩展名为 .SPL).
三、查看标准样MRM通道
1. 在MassLynx的主菜单栏，选择File – Open打开需要进行数据处理的样品表（在SampleDB文件夹）
2. 在样品表选择低浓度的标准样，点击，色谱图浏览窗口将显示该样品的第一个MRM色谱图
3. 若需要显示该样更多的MRM色谱图，点击，将出现如下窗口
4. 在中选择需要显示的MRM Function

5. 在中，双击MRM 选择需要的通道，所选色谱通道将显示在 中，如 ….
6. 在色谱图浏览页面使用下列图标

复制色谱图

积分

提取质谱图

即时更新色谱图
a. 若需要对所有谱图进行积分，点击Process - .
b. 对选定色谱图积分，则选择 Process- Integrate，点击 并选择 .
c. 平滑色谱图：选择Process – Smooth ，应用缺省设置 (Mean)，点击OK，选定色谱图将被平滑
四、建立TargetLynx处理方法
1. 点击 ，页面左侧将显示快捷菜单窗口。
2. 选择， 点击Edit Method ，设置处理方法参数
3. 在TargetLynx 方法编辑器中，点击 显示化合物属性
4. 在TargetLynx处理方法窗口的菜单栏 ，选择File – New，点击新化合物图标 创建在处理方法中创建一个新化合物.

5. 点击化合物属性图标 ，然后点击 展开更加详细的参数设置。切换至色谱图浏览窗口，按住鼠标右键, 在选定色谱峰上准确拖动，拖动范围刚好包括整个色谱峰，则相应色谱峰的各参数（质谱通道、保留时间、保留时间窗口等参数）将自动输入到Method Editor 窗口。

同时, 这些参数也可以手动输入，但是通道参数必须和色谱图显示的完全一致，包括质荷比的小数部分。 ( 如MRM的 264.10>181.10 不能输入成 264>181).
6. 然后切换至方法编辑的化合物属性页，检查输入的参数。

a. 在输入分析物名称
b. Acquisition Function Number： MS Method窗口的Function值，该值需和MS Method的Function Number一致。
c. Include Primary trace in response：选Yes，表示使用该通道的色谱图进行定量计算。
d. Use absolute mass window? 选Yes，质谱单位以Da计。
e. Concentration of Standards（标准品浓度）
对内标物选择Fixed（固定值），并在 concentration中输入 1.0 ；
对标准品选择Conc A，需要在Sample List窗口Conc A列验证输入的值是否准确。
f. Time Window（积分最为重要参数之一，保留时间窗口）：如果保留时间漂移比较明显，则需要设置大一点的时间窗口，对于GC/MS的色谱峰，通常可以先设0.2或0.3。
g. Peak Selection：选择保留时间窗口内的哪个峰积分。通常设成Nearest，但是如果时间窗口内的杂质峰较多时，需要尝试其他选择，如largest。
h. Response Type （响应类型）按如下选择，选择峰高或面积定量。
对使用内标法做校正曲线的:
对内标物，选择External (absolute)；
对标准品，选择Internal (relative)。
对使用外标法做校正曲线的:
对标准品，选择External (absolute)。
i. 若Retention Time Tolerance 的标记选择Yes，则需要输入保留时间范围限度的上下限百分比值。
j. 若Maximum Concentration Level的标记为，则需要输入最大的允许浓度值。当计算出来的值超过该限定值时，处理结果将出现警示标记，下同；
k. 若Maximum Blank Acceptance Response的标记，则需要输入最大的允许空白值。
l. 若Reporting Concentration Limit的标记，则需要输入最小的文献报道浓度值。
m. Recovery Level：回收率上下限，仅有在Flag Recovery Level? 标记为时，结果才可能出现警示标记。
n. 如果在 选 yes，需确认在样品表的栏中输入X 标记
o. In the area, enter the name for the combined peaks, and select whether the all compounds, named compounds, or unnamed compounds.
7. 点击校正曲线属性图标（ calibration properties ） ，然后点击 展开并设置各属性参数
a. 在 中输入化合物名称；
b. Polynomial Type – Linear：拟合曲线类型选择，通常选线性；
Point of Origin – Exclude：拟合曲线是否强制过原点，通常选不需要；
c. Fit Weighting：拟合权重
通常选择None。对需要对较低浓度的点增大拟合权重时，可选择1/X ，尤其对于在校正曲线的低浓度端的未知样品计算时使用。
d. Axis Transformation – None：坐标的值是否需要进行数学形式的变换，如取对数等，通常选择None。
e. Concentration Units：浓度单位
f. Calibration Reference Compound：校正曲线标准物质，需要与化合物名称一致。
g. 若Minimum Coefficient of Determination的标记为，则需要输入最小的允许R2值。当计算出来的值低于该限定值时，处理结果将出现警示标记；
h. h. 若需将校正曲线的属性使用于所有化合物时，需在 Propagate Calibration Parameters标记为。

8. 点击积分属性图标设置相关参数
a. 推荐使用色谱图平滑功能（ ）和 ApexTrack Peak Integration积分方式， 均标记为 ，平滑方法推荐使用缺省设置的Mean方式；
b. Smoothing Iterations：平滑次数
缺省值为1。通常不超过2.
c. Smoothing Width
缺省值为2。通常设为缺省值。
d. Smoothing method
对色谱图平滑–选 Mean，上述Smoothing Iterations可设为2。
对光谱图平滑- 选Savitzky Golay，上述Smoothing Iterations设为1。
e. 在输入缺省值2,该值的大小影响积分的起点和终点，是积分最为重要的参数之一，通常设为化合物属性页中Retention Time Window的10倍；
f. Minimum Signal/Noise Ratio –设定信噪比最小限制值。
g. Flag Signal/Noise Ratio ：若设定Yes，当实际测定样品的信噪比小于S/N设定值，计算结果页将出现警示标记。

9. 在Targeting Properties 页，设置以下参数：

a. ，与主峰一样，输入保留时间窗口（通常为色谱峰保留时间的 5-10% )。
b. 若 选择Yes，则处理方法的离子比率将。
c. 若Update Ion Ratios Using Multiple Samples?设为YES, 则参比离子比率以样品表中所有标记有“X”标记样品的离子比率平均获得。
d. 选择 Ratio 来计算 Calculate Ion Ratio Tolerance
注：欧盟食品安全的 MRL’s 和 MRPL’s 限度要求

e. Target Ion Ratio Method选择 Quan/Target
f. 输入Target Ion Trace
g. Target Ion Must Exist：Target离子必须存在；选 No 开启仅 TargetLynx结果警示，若选Yes，仅在target存在是，主峰才可被定量。
h. Target Ion Must Pass Ratio；选 No ，仅开启TargetLynx结果警示功能，若选Yes，仅在target ion比率通过，主峰才可被定量。
i. Calculate Ion Ratio As (Target/Primary)：Ion Ratio计算方式，选Yes，则为归一化法计算，离子比率＝所选择离子/最大离子。
j. 若需要利用第二对离子进行定性，则参考上述设置对 进行设置。.
10. 在Calculation Factors页, 检查下列参数:
a. 选择RMS的信噪比计算方法
b. 输入1为 Signal to Noise 计算因子
c. 界定噪音计算的范围（ Noise Window Start和End）
d. Measure Peak Signal level From选择Average Noise level
e. 输入Detection and Quantitation Limit（检测限和定量限因子，该因子与平均噪音水平相乘，积为检测限和定量限，LOD/LOQ），若实际的LOD/LOQ小于该设定值，结果将出现警示信息。

11. 其他组分参考上述方法进行
12. 选择 File - Save As，保存方法
五、样品进行定性和定量
1．在样品表中，选择要进行定量分析的样品，
2. 选择 TargetLynx ，在TargetLynx软件中，选择Process Sample。

3. 当出现如下窗口时，选择适当的TargetLynx处理方法，确认选择三项处理功能Integrate Samples, Calibrate Standards和Quantify Samples。

4. 点击 OK，TargetLynx软件就能根据所选的定量方法进行自动定量分析，并显示出定量结果
5. 在如下TargetLynx结果浏览窗口中，点击 View>Over View工具栏，中间的窗口将会出现，该窗口将显示所有超过TargetLynx方法中设定值的样品信息。

6. 如需要更新ion ratio, 点击Processing>Update Ion Ratio；
7. 点击File>Export>Method，选择适当的TargetLynx的处理方法；
8. 打开刚保存的TargetLynx方法，并确认ion ratio已经更新。
六、查看处理结果
1. 点击查看处理结果并打印报告
2. 打开处理过的TargetLynx数据：选择File – Import QuanData，在数据的存储路径中打开数据文件；
3. 若需要改变处理方法设置，选择Edit-Edit Method对方法进行修改，修改后，选择关闭窗口，按提示保存方法，并返回结果查看界面。
4. 选择 Processing – Execute，重新利用修改过的处理方法对数据进行处理
5. 选择View- Overview bar可以查看Target结果；如果结果中标记成红色，说明计算某些结果超过限度要求范围，单击红色区域，将显示所有不符合规定的项目详细信息。

6. 单击Display – Options可以自定义customize结果显示表格的内容，包括色谱图，综合表，校正曲线，以及字体和颜色：
a) 在 Summary区域选择 Summary – 并选择“List by compound”. 则结果表将按组分显示；
b) 点击View- Statistics，将显示同一浓度的多个样品的统计结果，如RSD。
c) 点击View – Totals Bar 在综合信息显示区域显示一个样品的所有组分信息。
7. 选择 Display - Slideshow 将以幻灯片显示方式依次显示各样品的结果
8. 打印结果：
d) 选择 File – Report Format 并设置报告格式
e) 选择 File – Print 打印结果
9. 导出样品信息 (Areas, Amounts, etc) ：
f) File - Export Current Summary –导出当前组分信息；
g) File - Export Complete Summary – 导出该样品的所有组分信息。
h) File – Export All Groups Summary 导出所有样品信息。
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