新版生物素亲合素放大技术市公开课金奖市赛课一等奖课件.pptx

第十一第十一章章 生物素生物素-亲合亲合素放大技术素放大技术第1页第1页第二节第二节 亲合素、链霉亲合素理化性质与标识亲合素、链霉亲合素理化性质与标识一、理化特性一、理化特性二、亲合素（或链酶亲合素）标识二、亲合素（或链酶亲合素）标识第一节第一节 生物素理化性质与标识生物素理化性质与标识一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素标识蛋白质二、活化生物素标识蛋白质第2页第2页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统特点亲合素系统特点一、灵敏度二、特异性一、灵敏度二、特异性三、稳定性四、合用性三、稳定性四、合用性五、其它五、其它思考题思考题小结小结第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统应用亲合素系统应用一、生物素一、生物素-亲合素系统基本类型及原理亲合素系统基本类型及原理二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中应用亲合素系统在酶免疫测定中应用三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中应用亲合素系统在荧光免疫技术中应用四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中应用亲合素系统在放射免疫测定中应用五、生物素五、生物素-亲合素系统在分子生物学中应用亲合素系统在分子生物学中应用第3页第3页维生素维生素H H 动、植物组织中广泛动、植物组织中广泛 分布分布,卵黄和肝含量高卵黄和肝含量高MW 244.31kD.MW 244.31kD.I I环为咪唑酮环，可与亲合环为咪唑酮环，可与亲合 素结合素结合环为噻吩环，环为噻吩环，C2C2上戊酸上戊酸 侧链未端羧基是结合生侧链未端羧基是结合生 物大分子唯一结构物大分子唯一结构 I I I I 咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环噻吩环噻吩环 羧基羧基第一节第一节 生物素理化性质与标识生物素理化性质与标识第4页第4页一、活化生物素一、活化生物素 生物素侧链末生物素侧链末端羧基经化学修端羧基经化学修饰后制成带各种饰后制成带各种活性基团衍生活性基团衍生物物活化生物素活化生物素(生物素化衍生物生物素化衍生物)第5页第5页生物素活化生物素活化活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体与抗原、抗体酶及核酸分子酶及核酸分子中相应基团偶中相应基团偶联形成生物素联形成生物素化标识物化标识物 标识蛋白质标识蛋白质氨基氨基活化生物素活化生物素 标识蛋白质标识蛋白质醛基醛基活化生物素活化生物素 标识蛋白质标识蛋白质巯基巯基活化生物素活化生物素 标识标识核酸核酸活化生物素活化生物素 第6页第6页活化生物素活化生物素标识蛋白质氨基活化生物素标识蛋白质氨基活化生物素BNHSBNHS分子可与蛋白质分子可与蛋白质 赖氨酸氨基形成肽键赖氨酸氨基形成肽键 BNHSBNHS合用标识抗体和合用标识抗体和 中性或偏碱性蛋白质中性或偏碱性蛋白质生物素生物素N-N-羟基丁二酰胺羟基丁二酰胺碳二亚胺碳二亚胺生物素羟生物素羟基琥珀酰基琥珀酰亚胺酯（亚胺酯（BNHS BNHS）如何减小空间位阻？如何减小空间位阻？长臂活化生物素长臂活化生物素（BCNHSBCNHS）：）：生物素和生物素和N-N-羟基丁二酰亚胺之间添羟基丁二酰亚胺之间添加了两个加了两个6-6-氨基已糖分子基团，形氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团成连结臂，生物素与大分子基团距离距离 第7页第7页标识蛋白质醛基活化生物素标识蛋白质醛基活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼与生物素合成物水合肼与生物素合成物 主要用于标识偏酸性糖蛋白主要用于标识偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ)(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。后，再与无水肼反应而成。除醛基外，除醛基外，BCHZ BCHZ还可标识氨基还可标识氨基第8页第8页标识蛋白质巯基活化生物素标识蛋白质巯基活化生物素马来酰亚胺马来酰亚胺-丙酰丙酰-生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)能特异地与蛋白质巯基结合活化能特异地与蛋白质巯基结合活化生物素生物素 第9页第9页标识核酸活化生物素标识核酸活化生物素光生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin)侧链上连接芳香基叠氮物基团侧链上连接芳香基叠氮物基团,经光照后经光照后,变为芳变为芳香香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成形成B-B-核酸核酸探针探针 第10页第10页生物素脱氧核苷三磷酸生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为作为TTPTTP结构类似物，可采用缺口移结构类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链位法掺入到双链DNADNA中。中。BNHS和和BHZ 可直接标识核酸，可直接标识核酸，但对但对碱基配对碱基配对有影有影响。响。第11页第11页活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标识多价性；一个蛋白分子可被多个生物素标识多价性；对对BNHS多标识抗体多标识抗体,BHZ则多标识微酸性抗原；则多标识微酸性抗原；抗原、抗体标识后活性不变；抗原、抗体标识后活性不变；可对标识材料（如酶）标识：碱性磷酸酶标识后可对标识材料（如酶）标识：碱性磷酸酶标识后 活性将减少；活性将减少；二、生物素标识蛋白质二、生物素标识蛋白质第12页第12页选择活化生物素：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标识基团依抗原或抗体分子所带可标识基团 种类（氨基、醛基或巯基）以及分子酸碱性；种类（氨基、醛基或巯基）以及分子酸碱性；控制生物素：控制生物素：蛋白质百分比蛋白质百分比 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜为宜为2:1,IgG2:1,IgG应用浓度应用浓度 0.5 0.55 5g/ml;生物素生物素1 13 3个个/Ag/Ag，3 35 5个个/Ab/Ab；使用交联臂减少空间阻力使用交联臂减少空间阻力第13页第13页第二节第二节 亲合素、链霉亲合素理化亲合素、链霉亲合素理化性质与标识性质与标识亲合素亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素天然特异性结合是生物素天然特异性结合物。并且，两者均为大分子蛋白，因此几乎所物。并且，两者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标识物质均能够同亲合素（有用于标识物质均能够同亲合素（AV）或链酶）或链酶亲合素（亲合素（SA）结合。）结合。第14页第14页结构结构 四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白 四肽链蛋白四肽链蛋白 无糖基无糖基PI PI 10.5 610.5 6结合位结合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 13 1315 1515 151818亲合素（亲合素（亲合素（亲合素（A A A A）链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素(SA)(SA)(SA)(SA)一、理一、理 化化 特特 性性第15页第15页二、亲合素二、亲合素/链霉亲合素标识链霉亲合素标识标识物：标识物：酶、胶体金酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）HRP-AV(SA)过碘酸钠、戊二醛过碘酸钠、戊二醛ABC/SABC 预制预制AV(SAV)-Biotin第16页第16页第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统特点亲合素系统特点一、灵敏度一、灵敏度二、特异性二、特异性三、稳定性三、稳定性四、合用性四、合用性五、其它五、其它第17页第17页第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统应用亲合素系统应用生物素与亲合素之间结合亲合力生物素与亲合素之间结合亲合力高、特异性强，各自均能够与各型大高、特异性强，各自均能够与各型大小分子结合，以及两者在结合反应时小分子结合，以及两者在结合反应时含有多级放大作用等优越性，使含有多级放大作用等优越性，使BASBAS及及其相关技术被广泛应用在各种标识免其相关技术被广泛应用在各种标识免疫分析技术领域中，尤其为标识免疫疫分析技术领域中，尤其为标识免疫检测自动化分析做出了极大奉献。检测自动化分析做出了极大奉献。第18页第18页一、生物素一、生物素-亲合素系统基本类型亲合素系统基本类型及原理及原理BABBAB法：法：Ag+BAb Ag-AbB Ag+BAb Ag-AbB A A Ag-AbB-A Ag-AbB-A BE BE Ag-AbB-A-BE Ag-AbB-A-BE 特点：以游离特点：以游离A A分别连接分别连接B-AbB-Ab和和B-E B-E 第19页第19页BABA法法Ag+BAb Ag-AbB Ag+BAb Ag-AbB AE AE Ag-AbB-A-Ag-AbB-A-BEBE特点：以特点：以A-E/SA-EA-E/SA-E代替代替BABBAB法中法中A A，省，省 却了加却了加B-EB-E环节环节第20页第20页3.3.ABC ABC法法 A+BE A-BE-ABC A+BE A-BE-ABC Ag+BAb Ag-AbB Ag+BAb Ag-AbB ABCABC Ag-AbB-Ag-AbB-ABC ABC 特点特点:将将BABBAB法中法中A A先与先与B-EB-E结合，制备成复合物结合，制备成复合物ABCABC第21页第21页二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫亲合素系统在酶免疫测定中应用测定中应用BASBAS在在ELISAELISA中应用中应用 生物素生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定亲合素系统在均相酶免疫测定 第22页第22页三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免亲合素系统在荧光免疫技术中应用疫技术中应用 BAS BAS用于荧光抗体技术，通常采用用于荧光抗体技术，通常采用BABA法，法，即用荧光素直接标识亲合素（或链酶亲即用荧光素直接标识亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标识生物素（抗体和荧光素标识生物素（BABBAB法）或荧法）或荧光标识抗亲合素（或链酶亲合素）抗体光标识抗亲合素（或链酶亲合素）抗体夹心法。夹心法。第23页第23页四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免亲合素系统在放射免疫测定中应用疫测定中应用BASBAS主要与免疫放射分析主要与免疫放射分析(IRMA)(IRMA)检测体系偶检测体系偶联，用于对终反应放大（联，用于对终反应放大（BABA法）法）BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反应后反应后B B、F F成份分离成份分离 第24页第24页五、生物素五、生物素-亲合素系统在分子生亲合素系统在分子生物学中应用物学中应用以生物素标识核酸探针进行定位检测以生物素标识核酸探针进行定位检测用用BAS制备亲和吸附剂进行基因分离纯化制备亲和吸附剂进行基因分离纯化将免疫测定技术与将免疫测定技术与PCR结合建立免疫结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原检测用于抗原检测 第25页第25页思考题思考题1.1.生物素分子结构特点是什么？生物素分子结构特点是什么？2.2.生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？3.3.亲合素或链霉亲合素分子结构、理化性质有何特点？亲合素或链霉亲合素分子结构、理化性质有何特点？4.4.为何亲合素、链霉亲合素含有为何亲合素、链霉亲合素含有“桥联桥联”作用？作用？5.5.亲合素、链霉亲合素能够被哪些示踪剂标识？亲合素、链霉亲合素能够被哪些示踪剂标识？6.6.为何生物素亲合素系统含有放大作用？为何生物素亲合素系统含有放大作用？7.7.生生物物素素与与亲亲合合素素或或链链霉霉亲亲合合素素结结合合是是否否与与抗抗原原抗抗体体结结合合相相同？同？8.8.生生物物素素亲亲合合素素系系统统放放大大是是反反应应过过程程还还是是单单一一检检测测信信号号能能量？量？9.9.生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标识免疫技术联接？生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标识免疫技术联接？10.10.如如何何将将生生物物素素链链霉霉亲亲合合素素放放大大系系统统用用于于所所有有双双位位点点ELISA?ELISA?第26页第26页小小 结结生生物物素素亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）系系统统含含有有多多级级放放大大独独特特效效应应，可可极极大大地地提提升升分分析析测测定定灵灵敏敏度度；两两者者之之间间高高亲亲和和、高高特特异异结结合合以以及及既既可可偶偶联联生生物物大大分分子子，又又可可连连接接标标识识材材料料特特性性，使使该该系系统统在在标标识识免免疫疫分分析析技技术术领领域域中中应应用用含含有有很很强强稳稳定定性性和和合合用用性性。该该系系统统有有二二种种基基本本类类型型：以以游游离离亲亲合合素素为为中中间间物物，分分别别连连接接包包括括生生物物素素化化大大分分子子待待检检反反应应体体系系和和标标识识生生物物素素BABBAB法法或或ABCABC技技术术；另另一一类类是是直直接接用用标标识识亲亲合合素素连连接接生生物物素素化化大大分分子反应体系进行检测子反应体系进行检测BABA法或法或LABLAB。第27页第27页在在生生物物素素亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）放放大大系系统统应应用用中中，无无论论采采用用酶酶、荧荧光光素素或或发发光光物物作作为为检检测测示示踪踪剂剂，均均是是待待测测抗抗原原与与生生物物素素化化抗抗体体反反应应形形成成复复合合物物后后，再再利利用用生生物物素素与与亲亲合合素素间间多多价价放放大大结结合合特特性性，或或直直接接与与标标有有示示踪踪剂剂生生物物素素结结合合（BABA、LABLAB法法），或或依依次次与与亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）、生生物物素素示示踪踪标标识识物物反反应应连连接接成成聚聚合合物物（BABBAB、ABCABC法法），最最后后使使待待测测反反应应信信号号被被放放大大，提升检测办法灵敏度。提升检测办法灵敏度。第28页第28页