食源性致病菌检验技术及质量控制.pptx

食源性致病菌检验技术食源性致病菌检验技术及质量控制及质量控制 食源性致病菌检验技术及质量控制第1页内容内容1.创伤弧菌检验创伤弧菌检验2.大肠菌群检验大肠菌群检验3.沙门氏菌检验沙门氏菌检验4.大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌O157:H7/NM:H7/NM检验检验5.副溶血弧菌检验副溶血弧菌检验6.空肠弯曲菌检验空肠弯曲菌检验7.金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验8.单核细胞增生李斯特菌检验单核细胞增生李斯特菌检验9.阪崎肠杆菌检验阪崎肠杆菌检验10.质量控制质量控制食源性致病菌检验技术及质量控制第2页创伤弧菌检验创伤弧菌检验食源性致病菌检验技术及质量控制第3页n没有国家标准没有国家标准n食物中毒诊疗食物中毒诊疗n国外相关标准国外相关标准n美国美国FDA BAMFDA BAM网络版网络版 第第9 9章章 弧菌弧菌 nNMKL NMKL 食品中致病性弧菌检验食品中致病性弧菌检验 1997 1997n加拿大加拿大 鱼和海产品创伤弧菌分离计数鱼和海产品创伤弧菌分离计数 MFLP-MFLP-73 199573 1995n日本食品卫生检验指征日本食品卫生检验指征 食源性致病菌检验技术及质量控制第4页n选择性增菌液选择性增菌液 碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水n选择性分离培养基选择性分离培养基 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂）琼脂 改良纤维二糖改良纤维二糖-多粘菌素多粘菌素B-多粘菌素多粘菌素E（mCPC）琼脂和纤维二糖）琼脂和纤维二糖-多粘菌素多粘菌素E（CC）琼脂平板）琼脂平板 探针克隆杂交显示，两种平板上都有探针克隆杂交显示，两种平板上都有95以上可疑菌落为创伤弧菌以上可疑菌落为创伤弧菌食源性致病菌检验技术及质量控制第5页n引发胃肠炎、伤口感染和原发性败血症引发胃肠炎、伤口感染和原发性败血症n人类感染是因为食用生或半生受污染海产品人类感染是因为食用生或半生受污染海产品,或是因为伤口接触了或是因为伤口接触了带菌海水或海洋动物带菌海水或海洋动物n罹患肝病、血色病个体易感者及免疫功效低下者罹患肝病、血色病个体易感者及免疫功效低下者,一旦感染创伤弧一旦感染创伤弧菌菌,更轻易发生致命伤口感染和原发性败血症更轻易发生致命伤口感染和原发性败血症,后者病死率超出后者病死率超出50n创伤弧菌是美国海产品消费引发死亡首要原因创伤弧菌是美国海产品消费引发死亡首要原因,美国州际贝类卫生美国州际贝类卫生委员会要求委员会要求,收获后经处理牡蛎中创伤弧菌限量不超出收获后经处理牡蛎中创伤弧菌限量不超出30 CFU/g。预计日本每年创伤弧菌败血症病例数约为预计日本每年创伤弧菌败血症病例数约为425例。大陆沿海地域例。大陆沿海地域也时有创伤弧菌散发感染汇报也时有创伤弧菌散发感染汇报食源性致病菌检验技术及质量控制第6页创伤弧菌（创伤弧菌（Vibrio Vibrio vulnificusvulnificus）n1976年首次发觉年首次发觉n引发引发 伤口感染伤口感染n致死性原发性败血症致死性原发性败血症n胃肠道感染胃肠道感染n曾称为乳糖阳性弧菌曾称为乳糖阳性弧菌n革兰氏阴性嗜盐菌革兰氏阴性嗜盐菌n兼性厌氧兼性厌氧n3个生物型个生物型食源性致病菌检验技术及质量控制第7页36 1 ，18 h24 h3940 或或36 1 ，18 h24 h36 1 ，12 h16 h样品样品25 g（mL）+225 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水氯化钠碱性蛋白胨水3氯化钠碱性蛋白胨水氯化钠碱性蛋白胨水3管管3个适当稀释度个适当稀释度假如进行定性检测，则不需要进行此步骤假如进行定性检测，则不需要进行此步骤挑取可疑菌落，接种于挑取可疑菌落，接种于3 3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生化试验生化试验或选取或选取API 20E生化判定试剂盒生化判定试剂盒结果汇报结果汇报改良纤维二糖改良纤维二糖-多粘菌素多粘菌素B-多粘菌素多粘菌素E琼脂琼脂或或纤维二糖纤维二糖-多粘菌素多粘菌素E琼脂琼脂划线分离划线分离筛选试验筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，氧化酶试验，革兰氏染色，3氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验食源性致病菌检验技术及质量控制第8页样品制备样品制备n非冷冻样品采集后应马上置非冷冻样品采集后应马上置710冰箱保留，尽可能及早检冰箱保留，尽可能及早检验；冷冻样品应在验；冷冻样品应在45 以下不超出以下不超出15 min或在或在25不超出不超出18 h解冻；假如样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量缓冲甘油解冻；假如样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），推荐贮存温度为氯化钠溶液（液体样品应加双料），推荐贮存温度为-70 以下。以下。n鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包含贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物中心部分，包含肠含贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物中心部分，包含肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取对应部分。干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取对应部分。食源性致病菌检验技术及质量控制第9页n以无菌操作取检样以无菌操作取检样25 g（mL），加入），加入3氯化氯化钠碱性蛋白胨水钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质，用旋转刀片式均质器以器以8 000 r/min均质均质1 min，或拍击式均质，或拍击式均质器拍击器拍击2 min，制备成，制备成1:10均匀稀释液。如无均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在放在500 mL灭菌容器内，加灭菌容器内，加225 mL 3氯氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。食源性致病菌检验技术及质量控制第10页增菌增菌n定性检测定性检测n将上述将上述1:10稀释液于稀释液于36 1 培养培养12 h16 h。食源性致病菌检验技术及质量控制第11页n定量检测定量检测n用灭菌吸管吸收用灭菌吸管吸收1:10稀释液稀释液1 mL，注入含有，注入含有9 mL 3氯化钠碱氯化钠碱性蛋白胨水试管内，充分混匀，制备性蛋白胨水试管内，充分混匀，制备1:100稀释液。稀释液。n另取另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用递增稀释一次，换用1支支1 mL灭菌吸管。灭菌吸管。n依据对检样污染情况预计，选择三个连续适宜稀释度，每个稀释依据对检样污染情况预计，选择三个连续适宜稀释度，每个稀释度接种三支含有度接种三支含有9 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水试管，每管接种氯化钠碱性蛋白胨水试管，每管接种1 mL。置。置36 1 恒温箱内，培养恒温箱内，培养12 h16 h。食源性致病菌检验技术及质量控制第12页分离分离n对全部显示生长增菌液，用接种环在距对全部显示生长增菌液，用接种环在距离液面以下离液面以下1 cm内沾取一环内沾取一环，于，于mCPC或或CC平板上划线分离。平板上划线分离。一支试管划线一一支试管划线一块平板块平板。于。于39 40 或或36 1 培养培养18 h24 h。食源性致病菌检验技术及质量控制第13页分离平板分离平板mCPCmCPC和和CCCC 经典创伤弧菌在经典创伤弧菌在mCPC和和CC平板上展现为圆、扁平、中心平板上展现为圆、扁平、中心不透明边缘透明黄色菌落，直径不透明边缘透明黄色菌落，直径1 mm2 mm。食源性致病菌检验技术及质量控制第14页纯培养纯培养n挑取三个或以上可疑菌落，划线挑取三个或以上可疑菌落，划线3氯化钠胰氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，蛋白胨大豆琼脂平板，36 1 培养培养18 h24 h。食源性致病菌检验技术及质量控制第15页初步判定初步判定n氧化酶试验：挑选纯培养单个菌落进行氧化酶试验，氧化酶试验：挑选纯培养单个菌落进行氧化酶试验，创伤弧菌为氧化酶阳性。创伤弧菌为氧化酶阳性。n涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性，呈棒状或弧状。观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性，呈棒状或弧状。n挑取纯培养单个可疑菌落，转种挑取纯培养单个可疑菌落，转种3氯化钠三糖铁琼脂氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，斜面并穿刺底层，36 1 培养培养24 h观察结果。创观察结果。创伤弧菌在伤弧菌在3氯化钠三糖铁琼脂中反应为底层变黄不变氯化钠三糖铁琼脂中反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，偶然斜面变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，偶然斜面变黄。黄。食源性致病菌检验技术及质量控制第16页nV-P试验：以接种针由试验：以接种针由3氯化钠三糖铁琼脂斜面挑取氯化钠三糖铁琼脂斜面挑取少许培养物穿刺少许培养物穿刺3氯化钠氯化钠MR-VP培养基，培养基，36 1 培养培养24 h，在加，在加V-P试剂前应先观察动力。沿穿刺试剂前应先观察动力。沿穿刺线周围呈扩散性生长为动力阳性。线周围呈扩散性生长为动力阳性。n嗜盐性试验：挑取纯培养单个可疑菌落，分别接种于嗜盐性试验：挑取纯培养单个可疑菌落，分别接种于不一样氯化钠浓度胰胨水，不一样氯化钠浓度胰胨水，36 1 培养培养24 h，观，观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、8氯化钠和氯化钠和10氯化钠胰胨水中不生长，在氯化钠胰胨水中不生长，在6氯化钠胰胨水中氯化钠胰胨水中生长旺盛。生长旺盛。食源性致病菌检验技术及质量控制第17页确定判定确定判定n生化试验：取纯培养物分别接种含生化试验：取纯培养物分别接种含3氯化钠氯化钠赖氨酸培养基，赖氨酸培养基，36 1 培养培养24 h48 h后观察结果。隔夜培养物进行后观察结果。隔夜培养物进行ONPG试验。试验。nAPI 20E生化判定试剂盒：刮取生化判定试剂盒：刮取3氯化钠胰氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上单个菌落，用蛋白胨大豆琼脂平板上单个菌落，用3氯化氯化钠溶液制备成浊度适当细菌悬浮液，使用钠溶液制备成浊度适当细菌悬浮液，使用API 20E生化判定试剂盒判定。生化判定试剂盒判定。食源性致病菌检验技术及质量控制第18页创伤弧菌生化性状创伤弧菌生化性状试验项试验项目目结结果果革革兰兰氏染色氏染色镜检镜检阴性，棒状或弧状阴性，棒状或弧状氧化氧化酶酶动动力力D-纤维纤维二糖二糖蔗糖蔗糖葡萄糖葡萄糖分解葡萄糖分解葡萄糖产产气气乳糖乳糖，或，或迟缓迟缓硫化硫化氢氢赖赖氨酸脱氨酸脱羧羧酶酶V-PONPG注：阳性；阴性。注：阳性；阴性。食源性致病菌检验技术及质量控制第19页汇报汇报n当检出可疑菌落生化性状符合表当检出可疑菌落生化性状符合表1要求时，要求时，汇报汇报25 g（mL）样品中检出创伤弧菌。）样品中检出创伤弧菌。假如进行定量检测，依据证实为创伤弧假如进行定量检测，依据证实为创伤弧菌阳性试管管数，查最可能数（菌阳性试管管数，查最可能数（MPN）检索表，汇报每检索表，汇报每g（mL）创伤弧菌）创伤弧菌MPN值。值。食源性致病菌检验技术及质量控制第20页大肠菌群检验大肠菌群检验食源性致病菌检验技术及质量控制第21页大肠菌群大肠菌群定义：一群在36条件下培养2448小时能发酵乳糖、产酸产气需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。卫生学概念，包含埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等细菌检验比较简单，所以被广泛用做水源卫生指标和食品加工卫生情况通用指标食源性致病菌检验技术及质量控制第22页大肠菌群计数大肠菌群计数n第一法 MPN法n第二法 平板计数法n第三法 Petrifilm测试片法食源性致病菌检验技术及质量控制第23页第一法 MPN法与原与原4789.3不一样不一样操作步骤不一样操作步骤不一样原方法：初发酵原方法：初发酵EMB分离培养分离培养染色，染色，复发酵复发酵汇报汇报现方法：现方法：LST初发酵初发酵BGLB验证验证汇报汇报食源性致病菌检验技术及质量控制第24页初发酵培养基不一样初发酵培养基不一样n原方法：乳糖胆盐肉汤乳糖胆盐肉汤n现方法：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤）肉汤LST肉汤 是国际上通用培养基。与乳糖胆盐肉汤作用和意义相同，但含有更多优越性，LST中选择性抑菌剂是月桂基硫酸盐，相对于胆盐稳定性更加好些。还有就是LST更轻易观察。食源性致病菌检验技术及质量控制第25页结果汇报单位不一样n原方法：原方法：MPN/100g(mL)n现方法：现方法：MPN/g(mL)食源性致病菌检验技术及质量控制第26页食源性致病菌检验技术及质量控制第27页大肠菌群PetrifilmTM测试片法nPetrifilmPetrifilmTMTM大肠菌群测大肠菌群测试片试片 是一个预先制备好培养基系统，含有VRB 培养基，冷水可溶性凝胶和TTC指示剂，可增强菌落计数效果。表面覆盖胶膜，可截留发酵乳糖大肠菌群产生气体。培养结束后计数红点周围有气泡菌落为大肠菌群数。食源性致病菌检验技术及质量控制第28页检样检样25g(ml)样品样品225ml稀释液稀释液,均质均质稀释稀释接种接种PetrifilmTM大肠菌群测试片大肠菌群测试片培养培养 36 1 C 24h 2h 计数红色带气泡菌落计数红色带气泡菌落计算菌落总数计算菌落总数汇报汇报食源性致病菌检验技术及质量控制第29页样品制备按大肠菌群MPN法样品制备方法进行。样品pH调整同大肠菌群MPN法中样品pH调整。即样品匀液pH值应在6.57.5之间，pH值过低或过高时分别用1M NaOH或1M HCl给予调整。食源性致病菌检验技术及质量控制第30页样品接种与培养n将待检样品选取适宜23个连续稀释度,每个稀释度接种2张张测试片。将PetrifilmTM大肠菌群测试片置于平坦试验台面，揭开上层膜，用吸管吸收1mL样液垂直滴加在测试片中央，将上层膜迟缓盖下，防止气泡产生将上层膜迟缓盖下，防止气泡产生和上层膜直接落下和上层膜直接落下，把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置最少静置最少1分钟以分钟以使培养基凝固。使培养基凝固。n 将测试片透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不不超出超出20片片，36 C 1 C培养培养24h 2h。食源性致病菌检验技术及质量控制第31页判读培养24h 2h后应马上计数，可目测、用标准菌落计数器、显微镜、或 PetrifilmTM自动判读仪来计数。红色有红色有气泡菌落气泡菌落确认为大肠菌群数。培养圆形圆形面积边缘上及边缘以外菌落不作计数面积边缘上及边缘以外菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不显著小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群浓度较高，需要深入稀释样品来取得准确读数。食源性致病菌检验技术及质量控制第32页结果汇报n1)选取菌落数在15150之间测试片作为计数标准;n2)选择菌落数在15150之间稀释度，平均菌落数乘以稀释倍数汇报之；n3)假如全部稀释度测试片上菌落数都小于15,则计数稀释度最低测试片上平均菌落数乘以稀释倍数汇报之；n4)假如全部稀释度测试片上均无菌落生长，则以()1乘以最低稀释倍数汇报之；n5)假如最高稀释度菌落数大于150个时，计数最高稀释度测试片上平均菌落数乘以稀释倍数汇报之；n6)计数菌落数大于150个测试片时，可计数一个或两个含有代表性方格内菌落数，换算成单个方格内菌落数后乘以20即为测试片上估算菌落数(圆形生长面积为20 cm2)。n7)最终菌落浓度单位以“cfu/g(mL)”表示。食源性致病菌检验技术及质量控制第33页沙门氏菌检验沙门氏菌检验食源性致病菌检验技术及质量控制第34页沙门氏菌肠道传染病 人类沙门氏菌病分为两大类:1、伤寒与副伤寒:在世界范围内显著下降,我 国仍有散在发生,时有局部暴发流行.2、沙门氏菌急性胃肠炎沙门氏菌急性胃肠炎:在世界,在我国呈 上升趋势,经过动物广泛分布,家禽和猪是 主要储存宿主,在食品和许多动物制品 中发觉,是传输主要原因.食源性致病菌检验技术及质量控制第35页沙门氏菌食物中毒沙门氏菌食物中毒 引发食物中毒最常见沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌 易引发沙门氏菌中毒食品：肉、蛋、乳类食品 中毒原因：1、食用病畜禽肉制品食品 2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染 3、用不洁净水外理食品食源性致病菌检验技术及质量控制第36页沙门氏菌检验流程沙门氏菌检验流程n前增菌：用无选择性培前增菌：用无选择性培养基使处于濒死状态细养基使处于濒死状态细菌恢复活力菌恢复活力;BPWn选择性增菌：使沙门氏选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌菌优势繁殖，其它细菌受到抑制受到抑制;SC+TTBn选择性平板分离培养：选择性平板分离培养：BS+XLD/HE/显色培显色培基基n生化试验：判定分离出生化试验：判定分离出来细菌是否符合沙门氏来细菌是否符合沙门氏菌生化谱，可采取菌生化谱，可采取API 20E等成套生化试剂等成套生化试剂n血清学判定：特异性血清学判定：特异性诊疗血清判定到种。诊疗血清判定到种。食源性致病菌检验技术及质量控制第37页沙门氏菌分类学地位n归于肠杆菌科沙门氏菌属n下设6个亚属：I、II、IV、V、VI及III（原亚利桑那菌属）n常见种：鸡沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌n形态与染色：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。n培养特征：需氧或兼性厌氧，最适温度37，7.2-7.4n营养要求：不高，普通培养基生长良好。食源性致病菌检验技术及质量控制第38页沙门氏菌检验方法步骤沙门氏菌检验方法步骤n沙门氏菌检验方法步骤是：沙门氏菌检验方法步骤是：n增菌培养增菌培养n接种判别培养基，分离菌落接种判别培养基，分离菌落n生化试验，判定到属和种；也能够用噬生化试验，判定到属和种；也能够用噬菌体试验判定到属菌体试验判定到属n血清学分型血清学分型食源性致病菌检验技术及质量控制第39页增菌培养增菌培养n首先是增菌培养基灵敏度。首先是增菌培养基灵敏度。n关于食品中是否带有沙门氏菌，各个国家标准关于食品中是否带有沙门氏菌，各个国家标准基本上是一样，即：基本上是一样，即：25克无。克无。n过去了解是过去了解是25克食品中不能检出沙门氏菌，不克食品中不能检出沙门氏菌，不过没有提出要测定增菌液灵敏度。过没有提出要测定增菌液灵敏度。n自从自从PCR试验技术推广应用以后，认为此项技试验技术推广应用以后，认为此项技术能够在术能够在含有含有510个细菌标本内取得阳性结个细菌标本内取得阳性结果。才使我们了解到果。才使我们了解到25克无是应该在克无是应该在25克食克食品中不能带有品中不能带有1个沙门氏菌。个沙门氏菌。食源性致病菌检验技术及质量控制第40页增菌培养增菌培养n国际上惯用沙门氏菌增菌培养基有国际上惯用沙门氏菌增菌培养基有3种，种，即：即：(1)亚硒酸盐增菌液或亚硒酸盐胱氨亚硒酸盐增菌液或亚硒酸盐胱氨酸增菌液，酸增菌液，(2)四硫磺酸盐增菌液或四硫四硫磺酸盐增菌液或四硫磺酸盐孔雀绿增菌液，磺酸盐孔雀绿增菌液，(3)氯化镁孔雀绿氯化镁孔雀绿增菌液。增菌液。n现行国家标准采取了现行国家标准采取了(1)亚硒酸盐胱氨酸亚硒酸盐胱氨酸增菌液，和增菌液，和(2)四硫磺酸盐孔雀绿增菌液。四硫磺酸盐孔雀绿增菌液。食源性致病菌检验技术及质量控制第41页沙门氏菌属和相关细菌判别沙门氏菌属和相关细菌判别1n沙门氏菌是赖氨酸阳性、氰化钾和沙门氏菌是赖氨酸阳性、氰化钾和pH7.2尿素尿素酶阴性；而弗劳地氏柠檬酸杆菌群则是赖氨酸酶阴性；而弗劳地氏柠檬酸杆菌群则是赖氨酸阴性、氰化钾和阴性、氰化钾和pH7.2尿素酶阳性。尿素酶阳性。n不过，甲型副伤寒血清型是赖氨酸阴性，沙门不过，甲型副伤寒血清型是赖氨酸阴性，沙门氏菌氏菌IV和和V是氰化钾阳性。在弗劳地氏柠檬酸是氰化钾阳性。在弗劳地氏柠檬酸杆菌群里，氰化钾和尿素酶也不是杆菌群里，氰化钾和尿素酶也不是100%阳性，阳性，而且也偶然出现赖氨酸阳性菌株。而且也偶然出现赖氨酸阳性菌株。食源性致病菌检验技术及质量控制第42页沙门氏菌属和相关细菌判别沙门氏菌属和相关细菌判别2n不过，沙门氏菌和大肠埃希氏菌不过，沙门氏菌和大肠埃希氏菌判别有一点例外，因为在沙门氏判别有一点例外，因为在沙门氏菌属内有硫化氢阴性菌株，偶然菌属内有硫化氢阴性菌株，偶然也有靛基质阳性菌株；在大肠埃也有靛基质阳性菌株；在大肠埃希氏菌种内，也有少数靛基质阴希氏菌种内，也有少数靛基质阴性菌株，偶然也有硫化氢阳性菌性菌株，偶然也有硫化氢阳性菌株。株。食源性致病菌检验技术及质量控制第43页生化判别试验生化判别试验n依据以上所述，可将以上五项生依据以上所述，可将以上五项生化试验编制成一份肠杆菌科常见化试验编制成一份肠杆菌科常见属、种生化试验简化诊疗表。主属、种生化试验简化诊疗表。主要用于沙门氏菌判定，依据情况要用于沙门氏菌判定，依据情况再补充几项试验，能够准确地判再补充几项试验，能够准确地判定肠杆菌科中最常见定肠杆菌科中最常见12个属。个属。食源性致病菌检验技术及质量控制第44页肠杆菌科常见细菌简化诊疗表肠杆菌科常见细菌简化诊疗表序号序号 硫化氢硫化氢 靛基质靛基质 赖氨酸赖氨酸 氰化钾氰化钾 尿素酶尿素酶 判判 定定 结结 果果 (pH7.2)A1 +-+-沙门氏菌属沙门氏菌属 A2 +-+沙门氏菌属，迟缓爱德华氏菌沙门氏菌属，迟缓爱德华氏菌A3 +-+97 -9494 弗氏柠檬酸菌群，奇异变形菌弗氏柠檬酸菌群，奇异变形菌A4 +-普通变形菌普通变形菌B1 -+/-大肠埃希氏菌，沙门氏菌属，大肠埃希氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属志贺氏菌属B2 -+-+/-大肠埃希氏菌，志贺氏菌属大肠埃希氏菌，志贺氏菌属B3 -+/-+-/+克雷伯氏菌族克雷伯氏菌族(注注)B4 -+/-+-普罗菲登斯菌属，摩根氏菌属普罗菲登斯菌属，摩根氏菌属 注：包含克雷伯氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷氏菌属，另做补充试验注：包含克雷伯氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷氏菌属，另做补充试验判定。判定。食源性致病菌检验技术及质量控制第45页附表使用说明nA1尿素 氰化钾 赖氨酸 判断结果 -甲副 -+沙门氏菌和 +-+沙门氏菌个别变体nA2 甘露醇 山梨醇 判断结果 +沙门氏菌 靛+-迟缓爱德华氏菌 B1 ONPG -沙门氏菌属 ONPG +大肠埃希氏菌属食源性致病菌检验技术及质量控制第46页肠杆菌科细菌生化特征肠杆菌科细菌生化特征n近一百年以来，有许多学者，为积累肠近一百年以来，有许多学者，为积累肠杆菌科细菌生化特征资料，付出了辛勤杆菌科细菌生化特征资料，付出了辛勤劳动。尤其是美国学者法默劳动。尤其是美国学者法默（Farmer,III）于）于1986年提出了包含肠杆菌科细菌年提出了包含肠杆菌科细菌近近100个种个种47项生化特征。伯杰氏系统项生化特征。伯杰氏系统细菌学手册第二版于出版，法默应邀细菌学手册第二版于出版，法默应邀作为该书中肠杆菌科作者。作为该书中肠杆菌科作者。食源性致病菌检验技术及质量控制第47页微生物分析仪微生物分析仪n微生物分析仪是细菌分类判定工具。该仪器对微生物分析仪是细菌分类判定工具。该仪器对细菌作出分类判定应该是按照权威细菌生化特细菌作出分类判定应该是按照权威细菌生化特征表作出。按理，商家应该向雇主提供细菌征表作出。按理，商家应该向雇主提供细菌判定编码表，该表内容应该与细菌生化特征判定编码表，该表内容应该与细菌生化特征表一致。使用者应该对该表进行审查，认为编表一致。使用者应该对该表进行审查，认为编码表数据可信。码表数据可信。n不过，因为生产工艺和试验条件限制，有几项不过，因为生产工艺和试验条件限制，有几项主要生化试验项目未能列入微生物分析仪中。主要生化试验项目未能列入微生物分析仪中。其中对肠杆菌科细菌判定主要试验有：氰化钾、其中对肠杆菌科细菌判定主要试验有：氰化钾、pH7.2尿素酶和靛基质试验。尿素酶和靛基质试验。食源性致病菌检验技术及质量控制第48页补充生化试验补充生化试验n试验者对于所取得生化试验结果试验者对于所取得生化试验结果有怀疑时，可用手工方法进行补有怀疑时，可用手工方法进行补充试验，直至认为试验结果可信充试验，直至认为试验结果可信为止。为止。食源性致病菌检验技术及质量控制第49页血清学分型血清学分型n沙门氏菌含有沙门氏菌含有 O抗原、抗原、K抗原和抗原和 H抗抗原。沙门氏菌血清学分型就是按照原。沙门氏菌血清学分型就是按照这些抗原成份进行分型。这些抗原成份进行分型。n普通先按照普通先按照O抗原分群，然后。再按抗原分群，然后。再按照照H抗原分型。假如这个血清型含有抗原分型。假如这个血清型含有K抗原，普通在抗原，普通在O抗原分群以后再检抗原分群以后再检验。验。食源性致病菌检验技术及质量控制第50页血清学分型注意事项血清学分型注意事项n标准菌株和试验室保留菌株做血清型判定时候，标准菌株和试验室保留菌株做血清型判定时候，往往比较顺利，新分离菌株做血清分型往往不往往比较顺利，新分离菌株做血清分型往往不顺利。顺利。n一是因为因子血清效价不高，难以覆盖所试验一是因为因子血清效价不高，难以覆盖所试验菌株。应该不要用灼热接种环去挑取血清。菌株。应该不要用灼热接种环去挑取血清。n二是因为菌株抗原性发育不良，尤其是二是因为菌株抗原性发育不良，尤其是 H抗原。抗原。能够接种在半固体琼脂上，促使能够接种在半固体琼脂上，促使 H抗原发育。抗原发育。n沙门氏菌抗原研究已经有近一百年历史，试验沙门氏菌抗原研究已经有近一百年历史，试验者应该熟悉抗原相关理论。者应该熟悉抗原相关理论。食源性致病菌检验技术及质量控制第51页验证菌株判定结果验证菌株判定结果n沙门氏菌判定结果应该含有完整血清学沙门氏菌判定结果应该含有完整血清学分型结果。假如只判定到分型结果。假如只判定到 O群，没有得群，没有得出抗原分型结果，往往不是沙门氏菌。出抗原分型结果，往往不是沙门氏菌。n只只H有在属和种判定结果是完全可靠情况有在属和种判定结果是完全可靠情况下，才能做出沙门氏菌未定型判定结论。下，才能做出沙门氏菌未定型判定结论。食源性致病菌检验技术及质量控制第52页大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验检验食源性致病菌检验技术及质量控制第53页一、常规方法n 检样n n25g(mL)+改良EC肉汤(mEC+n）225mln 快速筛选 阴性 n 361 1824h n 阳性 汇报nCT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板n 361 1824hn挑取可疑菌落510个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSIn n MUG-LSTn 361 1824h n 阳性 阴性n n非O157菌血清学试验n n生化试验nn报告食源性致病菌检验技术及质量控制第54页操作步骤n1 增菌 以无菌操作取检样25g(mL)加入到含有225mL mEC+n肉汤均质袋中，在拍击式均质器上连续均质12min。于361培养1824h。同时做阳性及阴性对照。食源性致病菌检验技术及质量控制第55页2.分离n 取增菌后或筛选试验阳性mEC+n肉汤，分别划线或适当稀释后取0.1mL涂布接种于CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板上，于361培养1824h，观察菌落。必要时将混合菌落分纯。在CT-SMAC平板上，发酵山梨醇菌落为红色；经典菌落为不发酵山梨醇圆形、光滑、较小无色菌落，中心展现较暗灰褐色，用接种针挑起时无拉丝现象。在改良CHROMagar O157显色琼脂平板上为圆形、较小菌落，中心呈淡紫色-紫红色，边缘无色或浅灰色。食源性致病菌检验技术及质量控制第56页n增菌后肉汤在取样前，应轻微摇摆混匀。n划线时应屡次往返，确保分离效果。n涂布时应适当稀释。n注意区分经典菌落，必要时分纯。大部分非O157 E.coli发酵山梨醇，仍有6%不发酵山梨醇，它们与摩根氏菌和哈夫尼亚菌一样在TC-SMAC上表现为与O157相同菌落特征。食源性致病菌检验技术及质量控制第57页3.初步生化试验n 在CT-SMAC和改良CHROMagar O157显色琼脂平板上挑取510个经典或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，于361培养1824h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，经典菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生H2S。置LST-MUG肉汤管于长波紫外灯下观察，阳性对照应无荧光产生，阴性对照应有荧光；对分解乳糖且无荧光菌株，在营养琼脂平板上分纯，于361培养1824h，并进行以下判定。食源性致病菌检验技术及质量控制第58页4.判定n4.1 血清学试验n 在营养琼脂平板上挑取分纯菌落，用O157:H7标准血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。血清凝集试验应做生理盐水对照。对于H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂管，检验动力，经连续传代3次，动力试验阴性，H7因子血清凝集阴性者，确定为无动力株。nCCP:先做O157血清凝集，后做H7因子凝集，注意自凝菌，用生理盐水做对照。食源性致病菌检验技术及质量控制第59页n4.2 生化试验n 用API20E或VITEK-GNI+或其它肠杆菌科生化判定试剂盒，按照生产商提供使用说明进行。n进行生化试验时应是用新鲜培养物（24h）。n菌液稀释应注意无菌操作，浊度应到达使用说明要求。食源性致病菌检验技术及质量控制第60页二、免疫磁珠捕捉法操作步骤操作步骤n1.增菌：同常规法。n2.磁珠分离：n2.1 将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1只Eppendorff管，然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每个Eppendorff管盖子，每管加入20LE.coli O157免疫磁珠悬液。食源性致病菌检验技术及质量控制第61页n n磁珠在加入前在混旋器上短暂混匀，不可猛烈震荡，磁珠在加入前在混旋器上短暂混匀，不可猛烈震荡，防止产生泡沫。防止产生泡沫。2.2 2.2 取取mEC+nmEC+n肉汤增菌培养物肉汤增菌培养物1mL1mL，加入到，加入到EppendorffEppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s10s。每个。每个样品更换样品更换1 1只加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，只加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，防止交叉污染防止交叉污染n n取样前混匀，避开脂肪层与杂质，必要时使用滤网。取样前混匀，避开脂肪层与杂质，必要时使用滤网。加样后马上混匀。对照同时做。加样后马上混匀。对照同时做。食源性致病菌检验技术及质量控制第62页2.3 结合：在1830环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在适合装置上转动或用手轻微转动10min，使E.coli O157与免疫磁珠充分接触。注意室内温度，确保结合时间。结合时不要将磁铁插入到磁板架中。用手转动时应轻轻颠倒Eppendorff管架，不可猛烈摇动。确保磁珠与O157结合。食源性致病菌检验技术及质量控制第63页n2.4 捕捉：将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不停地倾斜磁板架，确保悬液中和盖子上免疫磁珠全部被搜集起来，此时，在Eppendorff管壁中间显著可见圆形或椭圆形棕色聚物。n2.5 吸收上清液：取1支灭菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面经过免疫磁珠积聚物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸收上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复2.4步骤。每个样品换用1支加长吸管。食源性致病菌检验技术及质量控制第64页n免疫磁珠滑落：一些样品尤其是那些富含脂肪样品，其磁珠积聚物易于滑落到管底。在吸收上清液时，极难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50100L上清液于Eppendorff管中。假如在后续洗涤过程中也这么做话，脂肪影响将减小，也可到达充分捕捉目标。n2.6洗涤：从磁板架上移走磁板，在每个Eppendorff中加入1mL PBS-Tween20洗液，转动磁板架3次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤2.42.6。食源性致病菌检验技术及质量控制第65页n2.7 重复上述步骤2.42.5 n 洗涤共3次，动作要轻柔。吸收上清液至磁珠聚集物处时，应放慢速度。上清液吸收应尽可能完全。使用多块磁珠分离装置时，磁铁与磁铁应远离放置。2.8 免疫磁珠悬浮：移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮在100L PBS-Tween20洗液中。食源性致病菌检验技术及质量控制第66页n2.9涂布平板n 用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50L免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板一侧，然后用涂布棒将免疫磁珠涂布平板二分之一，再用接种环划线接种平板另二分之一。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于361培养1824h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板表面水分过多时，应在37下干燥1020min，涂布时防止将免疫磁珠涂布到平板边缘。食源性致病菌检验技术及质量控制第67页n2.10 菌落识别、初步生化试验、判定 同常规法。食源性致病菌检验技术及质量控制第68页不一样培养基分离效果nCT-SMAC：菌落较大，存在较多山梨醇发酵阴性细菌菌落生长，干扰O157检出。nCHROMagar O157：较多非O157菌落生长，菌落较大，影响O157菌检出n改良CHROMagar O157：非O157细菌生长较少且菌落相对局限，O157菌落特征性显著。食源性致病菌检验技术及质量控制第69页副溶血弧菌检验副溶血弧菌检验食源性致病菌检验技术及质量控制第70页概况概况副溶血性弧菌于副溶血性弧菌于1950年从年从日本一次暴发性食物中毒中日本一次暴发性食物中毒中分离发觉。该菌存在于近海分离发觉。该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、海水、海底沉积物和鱼类、贝壳等海产品中。在贝壳等海产品中。在37、pH7.7、含氯化钠、含氯化钠34%环环境中生长最好。主要引发食境中生长最好。主要引发食物中毒，尤以日本、东南亚、物中毒，尤以日本、东南亚、美国及我国台北地域多见，美国及我国台北地域多见，也是我国大陆沿海地域食物也是我国大陆沿海地域食物中毒中最常见一个病原菌。中毒中最常见一个病原菌。食源性致病菌检验技术及质量控制第71页本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%6%食盐水繁殖快速，每食盐水繁殖快速，每89分钟为分钟为1周周期，低于期，低于0.5%或高于或高于8%盐水中停顿生长。对盐水中停顿生长。对酸敏感，在酸敏感，在2%醋酸中或醋酸中或50%食醋中食醋中1分钟即分钟即可死亡。不耐热，可死亡。不耐热，56、5分钟即可杀死，分钟即可杀死，90、1分钟灭活。对低温及高浓度氯代钠抵分钟灭活。对低温及高浓度氯代钠抵抗力甚强。抗力甚强。食源性致病菌检验技术及质量控制第72页主要修改主要修改n将选择性增菌液由氯化钠结晶紫增菌液改为将选择性增菌液由氯化钠结晶紫增菌液改为3n氯化钠碱性蛋白胨水；氯化钠碱性蛋白胨水；n将选择性分离培养基由氯化钠蔗糖琼脂和嗜盐将选择性分离培养基由氯化钠蔗糖琼脂和嗜盐n菌选择性琼脂改为硫代硫酸盐柠檬酸盐胆菌选择性琼脂改为硫代硫酸盐柠檬酸盐胆n盐蔗糖琼脂和科玛嘉弧菌显色培养基；盐蔗糖琼脂和科玛嘉弧菌显色培养基；n增加增加API 20E诊疗试剂条及全自动细菌生化鉴诊疗试剂条及全自动细菌生化鉴n定仪定仪VITEK；n增加血清学分型；增加血清学分型；n将动物试验改为神奈川试验；将动物试验改为神奈川试验；n增加最可能数检索表。增加最可能数检索表。食源性致病菌检验技术及质量控制第73页样品制备样品制备n冷冻样品应在冷冻样品应在45 以下不超出以下不超出15min或在或在2 5 不超出不超出18 h解冻，若解冻，若不能及时检验，应放于不能及时检验，应放于15 左右保留；左右保留；