PCR技术培训讲座.pptx

PCR技术培训疾病的诊断分子诊断分子诊断影象学诊断细胞/组织诊断 临 床 诊 断免疫诊断生化诊断几乎所有的疾病都是基因病n科学研究已证明，基因可以揭示疾病的本质，人类几乎所有疾病都直接或间接与基因有关，在某种意义上都是基因病，基因（基因（gene）：基因是有遗传效应的DNA片段，是控制性状的遗传物质的功能单位。遗传效应是指能转录为 mRNA，继而翻译为蛋白质，或转录为核糖体RNA转运RNA的功能。PCR技术n1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR可以在短时间内倍增极微量DNA（理论上说,仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。PCR技术nPCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入疾病诊断的常规技术。1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。标准的PCR过程分为三步荧光荧光PCRPCR检测技术是在传统检测技术是在传统PCRPCR技术基础上，加入荧光技术基础上，加入荧光标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号，再通过专门的仪器（荧光荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCRPCR仪）对荧光信仪）对荧光信号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCRPCR检测检测相比，荧光相比，荧光PCRPCR检测技术不仅实现了检测技术不仅实现了PCRPCR检测从定性到检测从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCRPCR污污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCRPCR检测技检测技术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代表性的表性的PCRPCR检测技术，为检测技术，为PCRPCR检测技术临床应用打开了检测技术临床应用打开了方便之门，现已得到广泛应用。方便之门，现已得到广泛应用。荧光荧光PCRPCR检测技术简介检测技术简介 短柄圆环探针荧光PCR原理分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有2535个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由1530个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由58个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5端；淬灭基团一般连接在3端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。荧光标记n荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团 探针荧光标记及荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）影响分子信标的主要因素n分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。n另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度试剂盒组成1、痰DNA提取液2、PCR反应液 结核引物1和2、结核探针、TaqE、缓冲液（10mmol/L Tris-HCl）、dNTP、内参照模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡油3、PCR增强剂：MgCl24、强阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗）5、弱阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗）6、阴性对照：超纯水PCR反应特点 n特异性强 n灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。n简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。n对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。荧光荧光PCR-TB检测试剂盒的生产工艺流程检测试剂盒的生产工艺流程装入海棉垫中包装成品裂解液DNA提取液Taq酶dNTPbuffer石蜡油内参照引物1，2PCR反应液结核杆菌阳性质粒强阳性对照超纯水阴性对照PCR增强剂贴标签贴标签贴标签分装分装结核杆菌阳性质粒弱阳性对照贴标签稀释，分装内参照探针贴标签MgCl2贴标签玻璃珠固形物贴标签内参照模板结核引物1，2结核探针试剂盒检测操作方法 所有用于临床诊断的PCR检测均 应在卫生部批准的临床基因诊断实验室进行l核酸分离提取l试剂配制l扩增及检测实时荧光实时荧光PCR结果判读结果判读荧光PCR试剂盒检测结果组别组别涂片涂片培养培养即时荧光即时荧光PCRPCR例数例数百分率百分率()()肺结核肺结核+56/17856/17831315 5+-+6/1786/1783 34 4-+6/1786/1783 34 4-+32/17832/17818180 0-78/17878/17843438 8对照组对照组+-2/372/375 54 4-+1/371/372 27 7-34/3734/3791919 93种方法检测痰标本结果种方法检测痰标本结果GAPDHAAB BCT=CT her2/neu-CT GADPH HER2/NEU荧光域值（threshold）的设定 PCR反应管的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即：threshold=10sd cycle6-15.荧光域值设定在PCR扩增的指数期。菌种即时荧光PCR检测百日咳菌大肠杆菌布氏杆菌肺炎球菌堪萨斯分支杆菌海分支杆菌猿猴分支杆菌鸟分支杆菌胞内分支杆菌草分支杆菌戈登氏分支杆菌母牛分支杆菌偶发分支杆菌耻垢分支杆菌龟脓肿分支杆菌龟脓肿亚分支杆菌结核杆菌+结核杆菌的特异性检测结核杆菌的特异性检测Ct值 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值。C代表cycle，t代表threshold，Ct值的含义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值越小，起始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，就可从标准曲线上算出该样品的起始拷贝数。PCR诊断试剂生产管理要点1、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、分装的隔离实验室2、PCR试剂的生产区与检定区应严格分开3、专用原材料 PCR引物的设计要合理、合适，引物的合成要有固定的地方和设备，纯度能到达一定标准荧光定量荧光定量PCR试剂的质量检查试剂的质量检查操作程序操作程序n每次买来一批新试剂时，先观察外包装有无破损及有效期等，试剂运输过程中有无冷冻保存，如有异常，及时与厂家联系。n内包装：试剂是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。n试剂的灵敏度：取卫生部临检中心购买的已知拷贝数的血清1份，并稀释至10拷贝数，用新试剂检测，计算出灵敏度。n试剂的重复性：取从卫生部临床检验中心购买的已知拷贝数的血清1份，用新试剂稀释平行检测10次，计算出SD，CV%。CV%应在30%。n试剂的特异性：取临床标本10份（包括：低拷贝、高拷贝、阴性、高黄疸的标本各2份），用新试剂检测，用于考察试剂的特异性。荧光定量荧光定量PCR室内质控程序室内质控程序n每天门诊抽取病人血标本时，须先仔细认真核对化验单和病人姓名是否符合。n编完化验单号后，在对血标本进行编号时要仔细核对化验单的病人姓名与标本管上的姓名，不得有误。n每次试验中，须同时测定1份阴性对照与一份质控品。n首次制作质控图时（新批号开始时），采用“即刻法”质控方法，具体步骤如下：n将连续的质控测定值从小到大排列，即X1，X2，XNn计算均值(X)和标准差(S)n按下述公式计算SI上限和SI下限nSI上限=(X最大值-X均值)/2nSI下限=(X均值-X最小值)/2PCR定量为何要设内参照？定量为何要设内参照？影响影响PCR定量的主要原因有定量的主要原因有1、反应效率的差异：、反应效率的差异：可能为反应体系和可能为反应体系和PCR扩增仪的工作状态所致。由于扩增仪的工作状态所致。由于PCR产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极大改变产物的浓度。解决办法就是设差极小，也会极大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行内对照，使参照基因在同一反应管内进行PCR扩增，扩增，起到校正作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样起到校正作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。会影响两种模板。2、终产物浓度的影响：终产物浓度、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进入达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定PCR反应周期后间隔测定反应周期后间隔测定PCR终产物的浓度。终产物的浓度。PCR诊断试剂质量控制要点1、酶活性测定2、引物序列的确定3、PCR加样区、扩增区、检测区应严格分开4、选择特异、敏感及简单快速的PCR产物检测方法5、DNA聚合酶的活性及稳定性能达到一定的要求，并有固定的来源6、PCR产物检测方法要尽可能的可靠、快速方便7、PCR试剂盒的检定人员应进行专门的培训生产质量检定方法n引物引物 20%聚丙烯酰胺凝胶电泳，应只出现单一条带；紫外分光光度计测定A260/A280应在1.51.n分子信标探针的质控nTaq酶的质控 1、稳定性：放置于377天的实验Taq酶，与正常条件的Taq酶做对比实验，测定室内质控品B、G系列，B系列样品全部为阴性，荧光强度在，50以下；G系列样品应能测出1fg/ul DNA，待测酶与对照酶测定100fg/ul DNA的相对荧光强度均值相比波动不超过15。2、活性对比：待测Taq酶与对照Taq酶做对比实验，测定室内质控品B、G系列，B系列样品全部为阴性，荧光强度在，50以下；G系列样品应能测出1fg/ul DNA，待测酶与对照酶测定100fg/ul DNA的相对荧光强度均值相比波动不超过15。基因诊断市场前景基因诊断市场前景n基因诊断技术产品是重要的医药生物技术产品。生物技术是影响国民经济的四大科学支柱之一，被认为是21世纪科学技术的核心。美国国家临床检验标准委员会主席Enns断言，对于感染性疾病，以PCR检测技术为基础的基因检测技术必然取代传统的病原体检测方法。美国商务部把基因诊断作为21世纪对美国最具有战略意义的5个竞争性行业之一。PCR的假阴性和假阳性产生原的假阴性和假阳性产生原因因n假阴性：操作不当，试剂质量差（包括引物和探针设计不当）或过期、仪器设备不准确n假阳性：几乎均由污染所致基因诊断市场容量及发展前景n美国自然遗传学杂志2002年9月27日发表一项调查报告，列出了未来5至10年内最有希望为改善世界各国、特别是广大发展中国家人们的健康状况作出贡献的十大关键生物技术。这项调查综合了全球28位知名专家的看法，历时5个月完成。调查报告认为，十大关键生物技术中，位居第一位的就是针对传染病的分子诊断技术，包括聚合酶链式反应、单克隆抗体等技术。n根据2001年的国外著名杂志自然和科学刊登的文章和国际权威技术评估机构对基因诊断市场预测：全球基因诊断市场在今后10年内将以每年30%的速度增长，而其它传统诊断技术市场年增长率仅2-4%。美国商务部预测，到2007年美国基因诊断产业收入将达到200亿美元。n国家卫生部颁布的卫医发200210号件，允许临床基因扩增检验实验室设在二级以上医院，这意味着目前能够使用PCR检测技术的医院将从目前的600多家三级以上医院扩充至15,000多家的二级以上医院。这些举措的实施将对PCR检测技术的发展起到积极的指导和促进作用，使其市场潜力得到充分体现。