泡菜葡萄酒固定化酵母细胞发酵啤酒实验与酸奶制作(0001).doc

孙禹 生02 2010012376
同组姓名：张宇成
2012-4-23

关键词：泡菜、葡萄酒、固定化技术、啤酒发酵、酸奶
泡菜、葡萄酒、固定化酵母细胞发酵啤酒实验与酸奶制作
微生物学实验八——

泡菜、葡萄酒、固定化酵母细胞发酵啤酒实验与酸奶制作
生命科学学院 生02 孙禹 2010012376
实验日期：2012-4-23 同组姓名：张宇成

一、实验目的
1、学习并了解泡菜的制作原理
2、学习葡萄酒的酿制方法
3、学习酸奶制作方法
4、了解固定化细胞技术的方法和意义
5、了解酵母发酵产生啤酒的过程
6、了解纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别

二、实验原理
1、泡菜的制作
蔬菜上或老盐水中带有乳酸菌、酵母苗等微生物，可以利用蔬菜、盐水中的糖进行乳酸发酵、酒精发酵等，不仅咸酸适度，味美嫩脆，增进食欲帮助消化，而且可以抑制各种病原菌及有害菌的生长发育，延长保存期；另外由于腌制采用密闭的泡菜坛，可以使残留的寄生虫卵窒息而死。

2、葡萄酒的酿制
小型葡萄酒酿制实验是以葡萄为原材料，在不添加其他菌的情况下，利用葡萄表面的细菌进行室温下自然发酵。在实验过程中，通过观察记录发酵情况，测定重量变化曲线，待重量稳定时停止发酵，并品尝葡萄酒。

2、固定化技术
是将生物酶或细胞固定在一定的基质上，比之传统的方法，具有能多次使用菌体的特点。固定化研究开始于50年代,现在已经广泛应用在近代工业微生物技术上。在传统啤酒生产过程中，酵母细胞发酵一次即弃去菌体，而使用了固定化技术，固定化细胞能重复使用，发酵后菌体与发酵液易于分离，并且后处理工艺简单，成本低，还可连续发酵，过程自动化。

3、包埋法
是固定化技术的一种，是将微生物细胞均匀的包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不易漏出。由于在制作固定化细胞时，细胞和载体不起任何反应，细胞处于最佳生理状态；同时固定化细胞有载体为屏障，可避免外界不利因素的影响，因此能迅速增殖。增殖酵母凝集在凝胶表面形成浓厚的菌体层，因此酵母能迅速与基质接触，从而缩短周期，提高啤酒的产量。

4、啤酒生产过程
分为麦芽制造、麦芽汗制造、前发酵、后发酵、过滤灭菌、包装等几道工序。

5、有关酸奶的制作与饮用常识
发酵性酸乳饮料：以鲜奶或乳制品为原料进行发酵，添加水和增稠剂等辅料，经加工制成的产品。其中，由于杀菌方式不同，可分为活性乳酸菌饮料和非活性乳酸菌饮料。
酸奶对于人体健康非常有益，具有强化肠胃消化吸收功能，预防一些常见疾病，提高人体免疫力等功能。但饮用时还需要注意：
1，饮用时要适量，过多容易引起乳酸过高，影响胃肠道消化酶的分泌。
2，酸奶不宜蒸煮或空腹食用，因为加热或空腹时高浓度胃液会杀灭活性乳酸菌。
3，酸奶也不宜与氯霉素、红霉素等抗生素食用，会降低药效并产生一定副作用。
4，饮用后及时漱口刷牙，避免发酵产物损害牙齿。

三、实验仪器、材料和用具
实验用具：无菌滴管，无菌玻璃棒，无菌封口膜封好的100 ml三角瓶，冰箱，
恒温培养箱，锅和勺子，吸管若干支，一次性纸杯。

实验材料：啤酒酵母(五星啤酒厂)，三元原味酸牛奶，袋装无抗鲜牛奶；
白砂糖，盐，大白菜，萝卜，胡萝卜，白萝卜，生姜，凉白开水。

实验试剂（发酵培养基）：100ml麦芽汁（8%~10%）/250ml三角瓶；
2.5%海藻酸钠溶液5ml，10ml试管中灭菌；1.5% CaCl2 50ml，250ml三角瓶中灭菌；0.9%无菌生理盐水50 ml，100ml三角瓶中灭菌。

四、实验步骤
（一）泡菜的制作
①将各种蔬菜（包括大白菜，心里美萝卜，胡萝卜，白萝卜，生姜等）切成片状或小段，并取适量加入泡菜坛中，最好不要放辣椒。
②利用盐6-8%，糖5-6% (3,6,9%)，凉白开水的配方配制泡菜汤约2L也加入泡菜坛中；
③高浓度的盐水封口（每两天检查水位），室温发酵一周后品尝。

（二）葡萄酒的制作
①在尽量无菌条件下，挑选新鲜成熟的葡萄准备酿酒。
注意：一定要成熟，最好能测定糖酸含量，有助于发酵。
一定要挑选，防止污染。酿酒葡萄是不清洗，直接破碎后酿酒的。
②葡萄样品去除青籽及腐烂籽，去梗并用搅拌机破碎。
注意：用纱布挤压破碎就行了。滤出来的是葡萄汁，纱布上剩下的是皮渣。
③取200 ml葡萄浆置于无菌三角瓶中，并将剩余的葡萄皮及葡萄籽加入其中。
注意：葡萄浆糖含量160-220 g/L，置于无菌三角瓶中用开水烫洗
④随后加入亚硫酸使其有效的SO2含量为60 mg/L，调节pH为3.6，混匀，用封口膜密封，置室温下自然发酵。
注意：SO2可抑制杂菌的生长，调节pH值抑杂菌生长。
⑤每24小时称重1次，记录重量变化曲线。必要时拍照记录结果。
⑥到重量稳定时可以停止发酵，用4-6层新纱布过滤即可饮用。
⑦对照实验：可按比例加入20g/100L葡萄酒干酵母（用10倍活化，水温40℃， 活化20分钟，冷却20℃以下加入）。

（三）固定化酵母细胞发酵啤酒
①酵母菌体的培养：将培养24h的新鲜斜面菌种，接种于三角瓶中培养（该步骤已由助教完成）。
②酵母细胞的固定化：在5ml海藻酸钠溶液中，加入2ml预热至35℃的酵母培养液，混合均匀（该步骤已由助教完成）；以无菌滴管吸取混合液，滴管口离液面5cm以上，缓慢而稳定滴加到CaCl2溶液中， 即可得到直径约3mm左右的凝胶珠，全部滴入后钙化30min。注意无菌操作。
③装瓶和发酵：在无菌玻璃棒帮助下倒掉CaCl2溶液，倒生理盐水于制得的固定化好的酵母细胞的瓶子中，洗一次凝胶珠，弃去生理盐水。将100ml发酵培养基（麦芽汁）倒入制得的固定化小球的瓶子中，用无菌封口膜封号瓶口，25℃静止培养20h。过程注意无菌操作。
④品尝啤酒：发酵好之后进行品尝（若发酸或其他异味，不要喝）。

（四）制作酸奶
①制作：将袋装鲜牛奶（220ml/袋）若干袋倒入洁净的锅中，加入6%（w/v）的白砂糖，以及5%（v/v）的酸牛奶，充分搅拌至糖完全溶解，分装至若干个纸杯中（具体用量遗忘……）。
②发酵：用无菌封口膜封口，用洁净的白纸将纸杯口盖住，42 ℃进行发酵培养10-12 h，牛奶变为不流动的酸奶时，停止发酵。
③冷冻：置于冰箱中数小时，待冷却老熟后便成酸奶。
④品尝酸奶。

五、实验结果与分析
（一）泡菜的制作

图1 泡菜制作照片
泡菜的制作还是比较简单的，并且品尝后觉得味道很不错，而且没有出现污染、异味等情况，说明这一实验是比较成功的。另外由于周一班品尝时没有留下泡菜的照片记录，图1中所示照片均来自网络学堂中周四班同学的相应实验，在此特别表示感谢。

（二）葡萄酒的制作
葡萄酒称重数据见表1，表中对比可见未加酵母和加酵母组的实验结果。
时间
周一 17:00
周四 17:00
周五 22:00
周六 18:30
周日 8:00
称重者
-
朱明原
刘昱
程磊
王璇
未-1
190.4630
189.8580
189.6195
189.4322
189.1108
未-2
191.2140
190.5905
190.3377
190.1414
189.8461
未-3
182.4169
181.8218
181.5480
181.0250
179.5895
未-4
178.2229
177.6788
177.4396
177.2548
177.0314
未-5
171.9513
171.4212
171.1680
170.9744
179.5670
未-6
183.4216
182.8210
182.5789
182.3780
182.0579
Y-1
180.5658
172.7804
172.4720
172.2336
171.9667
Y-2
163.4284
156.7364
156.4490
156.2235
155.9734
Y-3
174.3188
167.0545
166.7699
166.5649
166.3217
Y-4
176.6927
168.9726
168.6908
168.4794
168.3262
Y-5
173.1239
165.7508
165.4722
165.2728
165.0486
Y-6
166.8921
159.6662
159.3722
159.1486
158.8954

表1 周一班葡萄酒称重数据

注：”未”表示未加酵母，”Y”表示已加酵母
表1中的称重数据作图可得图2，这里对实验组和对照组分别作图。
通过对比发现在未加酵母的实验组中，周一至周日葡萄酒重量的下降较小，其中有一组”未-5”由周六至周日重量有明显上升，可能是称重时有误差或者出现电子天平异常等情况。另外这六组数据虽然减少较小，但速率比较均匀，因此重量曲线呈现匀速下降的趋势。
相比于实验组，加入酵母的对照组均呈现明显的重量下降趋势，尽管遗漏了几次重量数据，但可以看出周一至周四几天内，六组数据呈现相同的下降趋势，而在随后几天中，下降逐渐趋于平缓，最终较为稳定。由此也说明酵母的加入加速了发酵，在发酵前几天内增殖、利用葡萄发酵充分，而一周后，发酵已比较充分。
图2 葡萄酒重量随时间变化曲线
在品尝葡萄酒时，实验组葡萄汁颜色较深，呈紫红色，而且葡萄的味道依然较浓，喝起来酒味略淡；而加入酵母的组颜色较淡，呈棕红色，并且酒味很浓。试验照片如图3所示。
在本次实验中，葡萄酒中未出现明显杂菌或霉菌，而且品尝后味道都比较可口。这也说明葡萄自然发酵能够得到较好的效果，但相比于加入酵母，主要由于微生物含量较少，其代谢水平较低，达到重量变化稳定期需要的时间更长。而对于对照组而言，一周的发酵已经达到稳定。

图3 实验组（无酵母，左）和对照组（加酵母，右）

（三）固定化酵母细胞发酵啤酒

图4 刚制好的凝胶珠（左）和发酵一天后的啤酒（右）
啤酒发酵实验可以说是非常成功的。啤酒中有一些气泡，并有凝胶珠浮在表面，闻起来酒香十分诱人。虽然本人从不喝酒，但感觉自制啤酒喝起来还是很可口的。另外我还尝了一下凝胶珠，觉得没什么味道，而且其实比较易碎，可能是发酵比较充分的缘故。所以由此可知凝胶珠的使用也是有寿命的，发酵几次后应该就比较松软难以使用了。

（四）制作酸奶

图5 自制酸奶
酸奶经过冷冻后，味道同样非常不错，让人不禁一饮而尽。图5是本实验中的酸奶，呈凝固态。由于我并未参与酸奶的制作，因此能够品尝到可口的酸奶还得益于实验者的准确操作与成功的实验结果。
六、实验小结与感想
本次实验报告包括了泡菜、葡萄酒、啤酒和酸奶的制作四个部分，其中泡菜和酸奶的制作由于是集体制作，参与较少，觉得略有遗憾，但通过这些实验去了解生活中食品的制作方法和原理，让我感受到微生物与生活的密切联系，还是非常有收获的。实验中印象比加深的固定化酵母技术，可以说是发酵技术上的一次重要创新，因此在实验中，更切身体会到这一方法的实用与巧妙。
总体来讲，本次实验贴近生活，而写实验报告时仍对品尝自己亲手制作的啤酒酸奶时的感受记忆犹新。最后特别感谢老师、助教的指点，感谢张宇成同学在实验中的配合。

七、思考题
1、你酿制的啤酒和酸奶风味如何？
答：啤酒和酸奶的实验是比较成功的，啤酒闻起来酒味较浓，对于我这种从不喝酒的人来说，口感觉得很不错。酸奶就更加好喝了，尽管已经吃过晚饭来看结果，依然一饮而尽，一边享受实验成果一边享受美味还是很幸福的。

2、谈谈固定化细胞技术的意义。
答：1、固定化技术使得细菌被固定后能够重复使用，减少了一次发酵造成的大量菌体浪费，节约了发酵成本。
2、固定化技术提高了发酵的效率，这是由于固定化细胞有载体为屏障，可避免外界因素影响，能够迅速增殖，从而在发酵时有效缩短了发酵周期，提高啤酒的产量。
3、这一操作使得发酵工序更便于操作，而且比传统工艺发酵效果更好，从工业生产角度来讲这一技术是非常理想的。

3、纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别？
答：纯种发酵顾名思义，是通过接种一种纯化后的微生物进行发酵，从而得到较为单一、固定的代谢产物。可以想象在生产过程中，如果纯种发酵混入杂菌，不仅得不到产物，还浪费了大量原料，后果十分严重。因此纯种发酵接种时要在严格无菌条件下进行，并且需要对发酵过程进行监控，避免发酵失败造成的损失。
相比之下，传统发酵是利用生活中常见的谷物进行发酵，菌种来源丰富多样，因此只需要保证基本的无菌操作，避免混入霉菌即可。本实验泡菜和葡萄酒的制作均属于此类。

4、为何有的同学无法制得凝胶珠而得到无规则的固体？
答：如果凝胶珠不是球形的，主要是固定过程中，滴入菌液操作有误：
1、如果滴入距离过近，液珠在空中未来得及因重力作用变成圆形，在滴入后钙化性状可能不规则。
2、滴入过程失误使得菌液滴到了三角瓶上，从而导致变形。
3、液体滴加过快，以致相邻液珠不能完全分开，形状也可能不规则。

5、为何选择无抗奶作为酸奶发酵原料？
答：首先，无抗奶相对于有抗奶而言，是不含任何抗生素的牛奶。牛奶中的抗生素主要来源于对奶牛进行的一些抗生素治疗，可能使其进入乳汁从而造成牛奶也具有抗性。
针对本次酸奶发酵实验，如果抗性奶作为发酵原料可能使乳酸菌的生长受到干扰，从而无法获得预期的发酵结果，影响酸奶的口味。另外抗性酸奶还可能使乳酸菌的代谢受到影响，从而产生对人体有害的物质，影响人的健康。对于某些过敏体质的人而言，抗生素还容易导致过敏，而长期饮用抗性奶还可能使病菌产生抗药性等等。

八、参考资料
《微生物学实验指导》，陈金春，陈国强主编，清华大学出版社，2005年8月第一版。