细胞传代和H·E染色.docx

细胞生物学实验 盛心磊 2009012337
Hela细胞的传代培养和HE染色
生92 盛心磊 2009012337
周四班 同组同学：王璇
一、 实验目的
1. 学习掌握细胞传代的方法。
2. 学习掌握Hela染色的原理以及方法。
二、 实验器材
显微镜、移液器、镊子、超净台、酒精灯、火柴、移液器、
三、 试剂
1. PBS溶液
以成品干粉加超纯水配制；过滤后121ºC 灭菌20 min，4ºC 保存
2. DMEM培养基
以超纯水配制，工作液含有10％FBS、1%双抗；过滤除菌、4ºC保存
3. 双抗（100X）
青霉素10000U/mL、链霉素10000ug/mL
4. 消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液
5. 4%甲醛-PBS溶液
6. 苏木精染液：
苏木精0.5g，无水乙醇10mL
硫酸铝钾25g，蒸馏水150mL
完全溶解后，混合均匀，加热煮沸3－5min，加入蒸馏水至500mL，最后加入0.1g碘酸钠
7. 盐酸酒精溶液：0.5mL盐酸、100mL 70%乙醇
8. 淡氨水：0.5mL氨水、100mL自来水
9. 伊红染液：0.5g伊红B、100mL80%乙醇
材料：
Hela细胞系
四、 实验原理
H·E染色法是组织细胞染色中常用的一种方法，H指苏木精（Hemataxyln），E指伊红（Eosin）。细胞经苏木精染液染色后，细胞核、粘液等呈蓝色，细胞质及其他成分不着色或着色较浅，且易褪色。苏木精染色后，用盐酸酒精分化及弱碱性溶液返蓝，细胞核呈深蓝色，而细胞质等不着色。再用伊红染细胞质，使细胞质中的各种成分呈现深浅不同的粉红色。
细胞核染色原理：
苏木精为碱性染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
细胞质染色原理：
伊红是一种化学合成的酸性染料，在一定条件下可使细胞质着色。细胞质的主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞质的染色与染液的pH值密切相关。当染液的pH值在胞质蛋白质等电点（4.7～5.0）以下时，胞质蛋白质以碱式电离，则细胞质带正电荷，就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子，与胞质蛋白质带正电荷的阳离子结合，使细胞浆着色，呈现红色。

五、 实验步骤
1. 细胞的传代培养
1) 镜检，观察并记录细胞状态。
2) 吸弃培养基，加入1mL PBS溶液洗去残余培养基。
3) 向培养皿内滴加200uL消化液，37ºC消化1－2 min。
4) 加500uL含10％血清的DMEM培养基（终止消化、悬浮细胞）。
5) 按比例分盘，进行传代培养。
6) 每盘细胞密度一致，细胞分散均匀。
7) 37ºC、5％CO2培养。
8) 细胞生长周期的观察，并记录。

2. H·E染色
1) 镜检：观察并记录细胞状态 。
2) 吸弃培养基，以PBS溶液（1mL）漂洗1-2次。
3) 以固定剂固定15分钟。
4) 吸弃固定剂，以蒸馏水洗。
5) 加入苏木精染液（1mL，可重复使用）染色十数分钟（随时镜检，以确定染色时间）。
6) 以流动的自来水洗。
7) 加入0.5%盐酸酒精溶液进行分色（数秒）。
8) 以蒸馏水洗。
9) 以流动的自来水洗。
10) 加入0.5%氨水溶液进行返蓝处理（数十秒）。
11) 以流动的自来水洗后观察，效果好则以蒸馏水稍洗。
12) 加入伊红染液染色（数秒）。
13) 以蒸馏水洗。
14) 观察并记录照相（细胞核呈紫色、细胞质呈粉红色，层次感分明）。

3. 整理
1) 实验前及实验结束后，用酒精将超净台台面擦拭干净。
2) 盛有胰酶-EDTA溶液的EP管，其中的溶液用完后丢弃。
3) 实验结束将废物缸中的物品丢弃，将废物缸洗净、控干水分，以酒精擦拭后置于超净台中。
4) 试剂放回冰箱冷藏室中。

六、 实验结果
1. 细胞的传代培养
通过显微镜观察发现，本次实验的细胞传代培养，分装的比较均匀，之后观察分装后两盘的细胞生长状况良好，贴比率较高。其中一盘用于H·E染色的观察，另一盘用于细胞的凋亡与检测。本次细胞的传代培养基本是成功的，贴壁生长的细胞数量还是很客观的，基本上达到了实验要求。

图1： Hela细胞的传代培养结果（苏木精染色后；放大倍数10x40）

细胞质
细胞核
2. 细胞的H·E染色
图2： Hela细胞的H·E染色结果（放大倍数10x40）

图3： Hela细胞的H·E染色结果（放大倍数10x40）
如图所示，图中细胞中染色较深。图中染成深紫色的一块区域是细胞核，边缘颜色较浅，为粉红色的一块为细胞质。如图中所标。可是由于伊红染色时间过久，导致整个染色结果偏红，细胞核区域面积较大，结果受到一定的影响。不过从图中还是明显可以看出细胞核与细胞质染色的差异，能够很容易辨认出细胞核的位置，说明本次染色基本是达到了一定的目的了。细胞核的染色并没有呈现出蓝色，这可能是由于伊红染色时间较长。如图1所示，用苏木精染色的过程中，在漂洗过后，我并没有看到细胞核呈现出蓝色，说明苏木精染色时间不够可能也是原因之一。

七、 分析与讨论
1、 Hela细胞传代实验的注意事项
Hela细胞的传代培养是一个细胞扩大培养的过程，由于Hela细胞具有无限繁殖的特点，所以只需要给与适当的生长条件，可以进行细胞的传代培养，获得更多的细胞。在传代这个实验整个过程当中有几点需要特别注意的事项：
1) 整个操作需要在细胞间的超净台进行工作，需要进行严格的无菌操作，避免受到污染。
2) PBS清洗可以多加一些PBS，保证培养液洗干净。
3) 消化液消化的时间要控制好，在确保消化完全的情况下不能消化太久。
4) 吹打细胞的时候要用小心吹打，以免产生很多气泡。
2、 H·E染色的影响因素以及注意事项
本次H•E染色基本上成功，但是与老师上课展示的图片有一定的差别，分析原因，总结如下：
1） 细胞核并没有呈现出蓝色或者蓝紫色，而呈现深紫色。可能是由于苏木精染色时间不够，也可能是伊红染色过度。之后用蒸馏水水洗多次，核区仍呈现深紫色，说明不是水洗时间不够造成的。
2） 深紫色区域较大，这一方面可能是染色时间较长造成的，另一方面也可能是因为观察到的Hela细胞正处于细胞分裂阶段，细胞核体积较大。
3） 返蓝时间没有掌握好。
影响H·E染色的因素有很多，以下为我自己认为比较重要的几点：
1) 固定作用：将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为“固定”。固定的作用在于：①防止离体组织、细胞自溶与腐败，保持组织、细胞与生活时相似的形态和结构；②使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使其保持原有的结构；③使组织中的各种物质沉淀、凝固后产生不同的折射率，形成光学上的差异，以便染色后易于观察和鉴别；④固定剂有硬化作用，可增加组织硬度，便于制片。
2) 分化作用：染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。组织切片经苏木精染色后，必须用0.5％盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞质吸附的苏木精染料脱去，再进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞质染色的分明，因此在H·E染色中分化是极为关键的一步。苏木精染色后的分化处理要适度，分化过度，细胞核染色浅，形态不清；分化不足，则细胞核染色过深，影响观察。观察切片由深蓝色变成红色或粉红色时，立即将切片置入自来水中终止分化。
3) 返蓝作用：分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色；在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5％盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而中止分化，再用弱碱性水（0.5％氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。所以返蓝的时间很重要，我的样品应该就是返蓝做的不好导致细胞核染色不清楚。
4) 伊红染色：伊红染色应该尽快，加入伊红后立刻吸出用水洗涤多次，否则就会有很多伊红残留在细胞上面。另外保持细胞潮湿也是很重要的一点。

3、 实验操作注意事项
1) 35mm平皿较浅，加液后移动时请拿稳，避免晃动。本次实验，在对细胞凋亡实验中的平皿进行操作的时候，有部分培养基渗入到平皿盖和侧壁之间，有可能导致污染（从结果上来看，影响不大）。
2) 除加消化液时，其他加液时避免直接冲击细胞。加液的时候沿着靠近侧壁的区域轻轻加入。
3) 操作时，不要使细胞长期暴露，勿使皿盖打开过久。
4) 勿使细胞长期处于干燥状态。尤其是在用显微镜进行观察的时候，要加入适当的液体。
5) 消化时间不宜过久，以免影响细胞活性。需要通过不断镜检确定是否终止消化。
6) 分盘后，将皿沿水平方向前后、左右各轻轻晃动几次，使细胞分布均匀。
7) H·E染色过程中苏木精和伊红染液都要冲洗干净。
8) 伊红染色要立刻吸出洗涤，否则就会染上很多红色。
9) 分化，返蓝要做到彻底，时间应该把握好。

4、 实验总结思考
通过本次实验，我第一次接触到了真正的细胞培养。之前都是从课本或者文章中看到的间接描述，今日终于能够亲手实验，感觉非常激动。在课上，我了解细胞传代培养的原理以及方法和具体操作时的注意事项，成功的进行了细胞的传代培养，获得了大量的Hela细胞。我们还学到了H·E染色的原理和方法，我明白了苏木精伊红染色的原理以及每步操作的意义和注意事项，最终在老师和助教的帮助下，掌握了H·E染色的方法。虽然实验结果并不是那么理想，出现了一些小问题，但总体上我还是非常满意的。
最后，感谢老师和助教们的指导与帮助。

八、 参考文献
1. 王宏英 吴逸等 《细胞生物学实验指导》 清华大学生命科学学院 2009
2. 翟中和 王喜忠等 《细胞生物学》（第3版） 高等教育出版社 2007

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