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方竹和合江方竹种质遗传多样性研究
刘跃钧基金项目: 丽水市重点科技合作项目( 计划编号: 4012)
作者简介: 刘跃钧( 1966-) , 男, 浙江松阳人, 教授级高工, 从事野生植物开发利用研究。;
陈世通2王立平3傅兵4
( 1丽水市林业科学研究院, 浙江丽水323000; 2丽水九龙国家湿地公园管理处, 浙江丽水323000; 3遂昌县林业局, 浙江遂昌323300; 4丽水职业技术学院, 浙江丽水323000)
摘要: 目的建立及优化方竹和合江方竹的ISSR-PCR反应体系, 分析其12个种质资源的遗传多样性。方法采用L16( 45) 正交试验建立、 优化ISSR-PCR反应体系, 利用该体系分析12个不同种源的方竹和合江方竹的遗传多样性。结果最佳ISSR-PCR的最佳体系为: MgCl22.5mmol/L、 dNTPs100μmol/L、 Taq0.8U、 引物0.1μmol/L、 DNA20ng、 1×ReactionBuffer。12个供试竹种被分为两大类群, 其中除方竹遂昌种源2外的其它方竹竹种亲缘关系相当接近, 归为一个亚群; 合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一个小亚群中。
关键词: 方竹; 合江方竹; 分子标记, 遗传多样性; 研究
寒竹属( ChimonobambusaMakino) 隶属于禾本科植物, 其下有八月竹、 大明山方竹、 寒竹、 毛环方竹、 武夷山方竹、 永善方竹、 大叶方竹、 合江方竹、 云南方竹等20余种。中国拥有全部种类, 其主要分布在秦岭以南各省区, 比较集中的地区如四川、 贵州等西南各省区。
表1寒竹属12种不同竹种采集地点
种质
代号
种名
种源
种质采集地点
1
合江方竹
丽水种源
丽水市林科院百果园
2
合江方竹
杭州种源
浙江省林科院竹种园
3
方竹
莲都种源1
莲都区城西村
4
方竹
莲都种源2
莲都区大港头镇栋头村
5
方竹
遂昌种源1
遂昌县贵阳林场
6
方竹
遂昌种源2
遂昌县三仁乡林业站附近
7
方竹
松阳种源1
松阳县竹源乡小竹溪村
8
方竹
松阳种源2
松阳县三都乡
9
方竹
松阳种源3
松阳县竹源乡后畲村
10
方竹
景宁种源
景宁县东坑镇杨斜村
11
方竹
庆元种源
庆元林场场部
12
方竹
杭州种源
浙江省林科院竹种园
由于竹子是一类生物学特性特殊的植物, 以地下鞭延伸为主的无性繁殖方式, 以及开花时间、 空间上的不确定造成有性繁育系统的缺乏, 因此在亲缘关系鉴定, 遗传图谱的建立等方面都存在着很大的困难。ISSR[1](intersamplesequencerepeat)分子标记由于不受环境及发育阶段的影响, 其技术已经越来越多的应用到竹类植物起源、 遗传多样性、 分类、 系统进化及构建遗传图谱等方面的研究。
利用ISSR分子标记分析浙江省内合江方竹( C．hejiangensis) 和方竹( C.quadrangularis) 不同种源之间的的遗传多样性, 为今后优良竹种的选育等提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料及来源
于 10月采集浙江省内寒竹属12种不同的种质资源( 见表1) 。其中10种采自丽水地区各县( 市、 区) , 2种采自浙江省林业科学研究院竹种园。采得的鲜嫩竹叶后, 置于-80℃冰箱保存备用。
1.2基因组DNA的提取
用PlantDNAMiniKit试剂盒( OMEGA公司) 抽提叶片组织的基因组DNA。利用琼脂糖胶电泳检测基因组DNA的大小及完整性, 并用UV-2802S(上海洪富仪器仪表有限公司)测定基因组DNA的浓度和质量。
1.3ISSR-PCR反应条件及程序
影响PCR结果的因素主要为: 引物、 TaqDNA聚合酶、 dNTPs、 模板DNA、 Mg2+, 借鉴杨本超[2]、 王涛[3]的反应体系及参数, 设计5因素4水平正交试验( 表2) 并利用正交实验进行适当优化。另外, 前期的研究发现, 反应体系中加入2%(v/v)去离子甲酰胺, 1%(v/v)甘油, 可提高PCR反应的特异性, 同时使条带清晰。本研究的ISSR-PCR反应程序初步确认为: 95℃预变性5min; 然后95℃变性45s, 50℃(退火温度随引物不同而变化)退火1min30s, 72℃延伸1min30s, 重复30个循环; 最后为72℃延伸10min, 4℃保存。
表2ISSR-PCR正交设计表
编号No．
因素和水平Factorandlevel
MgCl2(mmol/L)
dNTPs(μmol/L)
Taq/U
引物(μmol/L)
DNA/ng
1
1.0
100
0.2
0.1
10
2
1.0
200
0.4
0.2
20
3
1.0
300
0.6
0.3
30
4
1.0
400
0.8
0.4
40
5
1.5
100
0.4
0.3
40
6
1.5
200
0.2
0.4
30
7
1.5
300
0.8
0.1
20
8
1.5
400
0.6
0.2
10
9
2.0
100
0.6
0.4
20
10
2.0
200
0.8
0.3
10
11
2.0
300
0.2
0.2
40
12
2.0
400
0.4
0.1
30
13
2.5
100
0.8
0.2
30
14
2.5
200
0.6
0.1
40
15
2.5
300
0.4
0.4
10
16
2.5
400
0.2
0.3
20
1.4ISSR引物的筛选
参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列合成所用的ISSR引物, 共60条( UBC821-880) , 引物由北京全式金生物技术有限公司合成。以浙江省林科院竹种园合江方竹基因组DNA为模板, 进行引物筛选。
1.5电泳及染色
将筛选得到的引物分别以所有供试竹种基因组DNA为模板进行PCR反应。待反应结束后, 进行3.5%聚丙烯酰胺凝胶( EB染色) 电泳。用Dolphin-DOC+凝胶成像系统(Wealtec)进行分析, 并记录数据。DNA标准分子量为MarkerIII(北京全式金生物技术有限公司)。
1.6数据处理和统计方法
用Dolphin-DOC+凝胶成像系统自带软件结合人工方法读带, ISSR扩增电泳图谱的每一条清晰且能重复出现的带, 均为一个分子标记(marker), 代表一个引物结合位点。在相同的迁移位置上, 有带用1表示, 无带用0表示。采用NTSYS-pc2.10e分析软件计算样品间的遗传相似性系数, 同时用UPGMA(unweightedpair-groupmethodanalysis)进行聚类分析, 构建聚类图。
2结果
2.1正交试验
表3正交试验分析表
编号
MgCl2
dNTPs
Taq
引物
DNA
k1
4.75
8.5
3.5
6.55
5
k2
3
6.0
3.75
3.5
6
k3
4.5
2.75
4
5.5
4.5
k4
7.15
1.75
8.25
3.75
3
R
4.15
6.25
4.75
3.05
3
按照清晰度、 重复性及条带多少等遗传多样性的分析要求进行评分, 最佳组合记16分, 最差组合记1分。根据分数的不同求出每个因素水平下的平均值ki以及同一因素不同水平间的平均值的极差R。
根据表4分析结果, 能够得出各因素对寒竹属竹子ISSR-PCR反应影响大小顺序为:
dNTPs>Taq>MgCl2>>引物>DNA。正交试验的统计分析结果( 表3) 与电泳结果( 图1) 对比显示, 统计分析结果与第13组体系比较接近, 在引物及DNA的用量上稍有差异。其中, DNA用量、 引物浓度分别在20ng及0.1μmol/L时ki最高, 反应水平最高。引物浓度与扩增产物的质量有一定的关系, 引物过少扩增量不足, 浓度过大引起非特异性扩增或产生引物二聚体, 因此要选择适宜的引物浓度。
DNA是PCR反应的模板, 有较宽的浓度选择范围, 其制约扩增产量及特异性, 太少时无扩增谱带; 浓度过高可能会造成非特异性扩增或弥散。最终确定寒竹属竹子ISSR-PCR的最佳体系为: MgCl22.5mmol/L、 dNTPs100μmol/L、 Taq0.8U、 引物0.1μmol/L、 DNA20ng、 1×ReactionBuffer。
图1 正交试验电泳图

表4引物编号及其序列Y=(C或T)R=(A或T)
引物编号
PrimerCode
引物序列
SequenceofPrimers
UBC835
UBC843
UBC854
UBC855
UBC868
A(GA)7GYT
C(TC)7TRC
T(CT)7CRG
A(CA)7CYT
(GAA)6
2.2引物筛选
本研究以省林科院竹种园合江方竹基因组DNA为模板, 从60条ISSR引物中筛选出5条引物( 表4) 。它们能扩增出清晰的条带, 而且稳定性和多态性都较好。这5条有效的ISSR引物在12份寒竹属竹种中共扩增出79条DNA带, 条带大小为100-3000bp, 具体扩增结果见表5。引物UBC855扩增出的清晰条带最多, 为18条; 引物UBC854的扩增条带数最少, 仅有12条。其中引物UBC868扩增条带的多态性比率最高, 为100%。总体上, 5个有效引物共产生47条多态性带, 平均多态性比率为59.4%, 说明这些ISSR标记在寒竹属竹种基因组中能揭示较多的信息量。5个引物都能用来建立不同竹种的指纹图谱, 其中引物UBC868的区分效果最好。
2.3寒竹属竹种之间的遗传相似性分析
用NTSYS-pc2.10e统计软件计算各样品间的Jaccard遗传相似性系数, 结果见表6。12个寒竹属种质资源遗传相似性系数分布于0.2353-1.000之间。
表55个有效ISSR引物的扩增结果
引物编号
Primercode
扩增带数/条
Totalamplifiedbands/band
多态性条带/条
Numberofpolymorphicbands/band
多态性比率/%
Percentageofpolymorphicbands/%
UBC835
UBC843
UBC854
UBC855
UBC868
总数Total
平均Average
17
15
12
18
17
79
15.8
7
6
6
11
17
47
9.4
41.2
40.0
50
61.1
100
292.3
59.4

表612个寒竹属竹种的Jaccard相似性系数
种质代号
3
12
7
10
9
4
11
2
5
8
1
6
3
1.0000

12
0.8824
1.0000

7
0.8824
1.0000
1.0000

10
0.8824
1.0000
1.0000
1.0000

9
0.9412
0.8235
0.8235
0.8235
1.0000

4
0.8824
0.7647
0.7647
0.7647
0.9412
1.0000

11
0.8824
0.7647
0.7647
0.7647
0.9412
1.0000
1.0000

2
0.5294
0.4118
0.4118
0.4118
0.5882
0.6471
0.6471
1.0000

5
0.9412
0.8235
0.8235
0.8235
1.0000
0.9412
0.9412
0.5882
1.0000

8
0.9412
0.8235
0.8235
0.8235
1.0000
0.9412
0.9412
0.5882
1.0000
1.0000

1
0.3529
0.2353
0.2353
0.2353
0.2941
0.3529
0.3529
0.5882
0.2941
0.2941
1.0000

6
0.4706
0.3529
0.3529
0.3529
0.4118
0.3529
0.3529
0.5882
0.4118
0.4118
0.5294
1.0000
2.4寒竹属竹种之间的聚类分析
在基于Jaccard遗传相似系数的UPGMA聚类图(图2)中, 我们把12个供试竹种分为两大类群: 合江方竹丽水种源, 合江方竹杭州种源, 方竹松阳种源1聚成一个类群, 其余9个竹种聚成另一个大类群。合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源虽归到一个小亚群中, 但相似性系数不是很高, 只有0.5582。

图212个寒竹属竹种的UPGMA聚类图
3讨论
研究结果表明, 除方竹遂昌种源2外的其它方竹竹种亲缘关系相当接近, 相似性系数介于0.7647-1.0000之间, 其中方竹松阳种源2、 3, 方竹遂昌种源1, 为同一竹种; 方竹莲都种源2和方竹庆元种源为同一竹种; 方竹杭州种源、 方竹景宁种源和方竹松阳种源1为同一竹种。能够认为, 相同的几种方竹竹种可能引至一样的原产地。至于方竹遂昌竹种2具体为何竹种, 有待经过形态学、 分子生物学等手段做进一步考证。合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源虽归到一个小亚群中, 但相似性系数只有0.5582, 可能是受环境因素影响或者引种混乱所致, 同样需要做进一步的研究。
虽然ISSR分子标记技术在寒竹属竹种亲缘关系鉴定上的运用当前未见报道, 但其它分子标记技术在竹类植物的研究上有较多应用。Watanabe[4-5]等以及Kobayashi先后利用RAPD分子标记技术研究了世界和亚洲竹类植物的系统分类和进化关系;Gielis等[6]利用RAPD分子标记技术研究了刚竹属42种31个种下等级的差异;Trevor等[7]利用ITS序列结合AFLP分子标记技术研究了刚竹属种之间的亲缘关系, 测定了刚竹属20个竹种的ITS序列, 同时利用AFLP分子标记技术进行了分析比较。
经过本研究部分理清了丽水市各县市引种的合江方竹及方竹的亲缘关系, 为今后的研究及寒竹属竹种笋竹两用林的发展奠定了一定基础。
参考文献:
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［6］GielisJ, Everaertl, LooseM.GeneticvariabilityandrelationshipsinPhyllostachysusingrandomamplifiedpolylnorphicDNA［M］.London:AcademiePress.1997:107-124．
［7］TrevorRHodkinsonetal.AComparisonofITSNuclearrDNASequenceDataandAFLPMarkersforPhylogeneticStudiesinPhyllostachys(Bambusoideae,Poaceae)［J］.JournalofPlantResearch, ,113:31．