病毒接毒及其后续管理.docx

病毒（TuMV）接种及其后续管理
1 病毒接种
1.1 浸润接种——侵染性克隆
（1）浸润选择健康无胁迫植株，如发生难以浸润现象，应弃置不用。
（2）浸润前将需要的农杆菌菌株在平板上活化，平板继代培养2次，液体培养基可多次继代培养，活化之后的农杆菌在1周之内使用。
（3）农杆菌以平板形式保存不超过1月，平板继代不超过2次。
（4）-80℃保存时应注意采用高浓度（10×）保存，以甘油：液体培养基保存。
（5）选取对应PDS指示的完全白化的两片叶子（一般为第3、4片），进行浸润接毒。一般以接毒2片叶子为宜。应完全浸润，不宜用注射器在同一片叶上注射次数过多，一般2次为宜，以防浸润叶坏死。
1.2 摩擦接种
（1）摩擦接种一般在VIGS后7-12天左右，PDS至少有3-4片叶子完全白化。
（2）摘取感病植株叶片（最好是系统叶），置于研钵，滴加少许PBS，研磨成均匀液体。
（3）选取对应PDS指示的完全白化的两片叶子（一般为第3、4片），洒少许金刚砂，进行摩擦接毒。一般以接毒2片叶子为宜。金刚砂不宜洒过多，也可将金刚砂洒于植物汁液，不时搅拌。
（4）摩擦接毒时，尽量保持摩擦力度、摩擦次数一致。可用海绵、棉签、徒手摩擦接种。
（5）摩擦接毒完毕后，应用少量水喷洒于接种叶，以除去多余金刚砂和接种汁液，保证后续照片摄制质量。
2 接种（TuMV）时间表
播种→10天后→移栽→3周左右后→VIGS→7-12天后→观察、拍照→接毒→2-7天→观察、拍照→留苗观察一周
3 接种前后观察与拍照
3.1接种前：VIGS后，接种前，观察并拍照VIGS表型。
（1）在白色荧光灯下，选取典型的2-3株植株，将gus与实验组放置一起，加上标尺，拍摄俯视照片，并记录表型。
（2）若实验组有明显株高差异，可拍摄正视照片，并记录表型。
（3）若有生长表型，可在白色荧光灯下，用微距镜头拍摄系统叶等细节。
3.2病毒上接种叶后：约2-3天后观察接种叶病毒。
（1）可在接种后48h、60h、72h、84h等对接种叶进行观察，记录表型。
（2）选取某一个典型时刻，拍摄紫外灯下接种叶、白光下整株、白光下接种叶。
3.3病毒上系统叶后：约3-6天后观察系统叶病毒。
（1）可在接种后3-6天，每天早上、下午、晚上对系统叶进行观察，记录表型。
（2）选取某一个典型时刻，每天拍摄紫外灯下系统叶、白光下系统叶症状。
4 拍摄技巧
4.1细节选取微距镜头，整株选取短镜头。
4.2可选择M模式，固定光圈大小（7.1、8.0、9.1），调节曝光时间从过亮到过暗。
4.3设置参数，ISO选取100（降低噪音，光线暗），3200或6400（光线亮，噪音多）。拍摄模式为阴影或阴天，单次拍摄，自动对焦。
4.4拍摄时，保证整株叶片完整并占据整个屏幕。
5 注意事项
5.1注意污染，接毒后植株不与健康植株相邻。触摸过接毒植株的手套、手不触摸健康植株，研钵等不随意放置于地上，需垫上干净手套。
5.2注意栽培条件，同一处理植株放置于同一架子，保证栽培条件相近。
5.3每组（每盘）设置对照。
5.4有条件可多设置平行。4株在VIGS后不接毒，观察VIGS表型，可取样验证沉默效率。4株接毒后观察接毒表型，可以取样检测病毒积累量。
5.5 摩擦接毒、VIGS等之前，先浇足量的水。