心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)综述资料.doc

心肌肌钙蛋白I检测试剂盒
（胶体金法）

综 述 资 料

申报产品名称：心肌肌钙蛋白I检测试剂盒（胶体金法）

申 报 单 位：常州博闻迪医药科技有限公司

申 报 时 间：2014年4月8日

综 述 资 料

1．概述：
1.1 产品预期用途：
用于临床体外人体全血、血浆或血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平的定量或定性检测。
1.2 与预期用途相关的临床适应症背景情况：
随着人们生活质量的提高，冠心病成为影响人群健康的主要疾病。急性心肌梗死（AMI）则是造成冠心病人死亡的主要原因。如何及时地发现急性心梗病人并及早采取溶栓及其相应的介入治疗是挽救病人生命的关键所在。临床常用的急性心肌梗死的诊断方法包括：临床表现、心电图改变和血液生化指标的改变等。目前，心电图的特异性改变是急性心肌梗死早期诊断的常用方法。然而，约有30-50%患者的心电图改变呈非典型性
或变化不明显，不能仅以心电图确立诊断，必须依赖于心肌生化指标的改变而确诊。以可疑急性心肌梗死入院的病例中只有30%左右的患者最终被确诊为心肌梗死。但这些可疑病例都要进行临床监测，以排除急性心梗的诊断。目前临床所用的生化指标检测手段多种多样，胶体金法是最为常用的快速检测手段之一。
心肌源性肌钙蛋白I（Cardiac Troponin I, 简称cTnI）是一种重要的心肌组织损伤特异性标志物，临床广泛用于急性心肌梗死及其它心肌损伤性疾病的辅助诊断。一般在心肌梗死后2-4小时血液浓度升高，12-24小时达高峰。cTnI可持续在血液中保持较高的浓度达4-10天。肌钙蛋白Ｉ检测的特异性很高。因此，采用胶体金法，开发一快速、简便、准确并且费用低廉的急性心肌梗死的诊断试剂盒具有重要的临床意义。

1.3 相关的临床或实验室诊断方法等：
二十年前，世界卫生组织(WHO)制定了AMI的诊断标准，下列三组情况必须同时存在两组才能诊断为AMI：1、有剧烈而持久的胸痛史；2、明确的心电图改变，包括ST段抬高和异常的Q波出现；3、系列酶的水平的改变，早期浓度升高，随后恢复正常浓度。在这一诊断标准中，心电图占有重要地位。心电图可以反映心肌缺血及坏死体征，前者常表现为ST段及T波变化，后者多见QRS波变化。这些标准是采用标准12导联心电图对比临床及病理解剖资料建立的。但并非所有心肌坏死都表现为ECG的变化，因此心电图正常并不能排除AMI。
随着我们步入二十一世纪的到来，诊断AMI的有关标准有了划时代的改变。AMI诊断标准包括三个方面：病史与症状、ECG表现和生化标志物。心肌损伤标志物起初选用肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、和乳酸脱氢酶(LDH)作为心肌梗死的标志物。80年代CK的同工酶CK-MB和LDH的同工酶LDH1一度被认为是AMI诊断的“金标准”，实际上，这些标志物不仅用于AMI的诊断，还用于评价有急性缺血性综合症病史的患者的心肌坏死情况。但这些传统标志物在其它非心肌疾病中也会有所升高，如在骨骼肌损伤修复期，分化较差骨骼肌亦可大量表达CK-MB、LDH1［3、5］。另外，在缺血性综合症的发病初期以及微小心肌损伤过程中，这些指标的临床敏感性并不理想，所以近来发展并研究了一些新的生化标志物。
近来分析技术的发展也提高了CK-MB的诊断价值，它可更早更敏感地反应心肌损伤。将CK-MB单克隆抗体与抗M或抗B型抗体联合使用的免疫分析方法能够精确地检测出AMI早期CK-MB微小的变化，在梗塞后3小时和6小时内分别有50%和超过80%的患者出现阳性。但是，CK-MB在AMI诊断参考方面仍存在两个限制因素。首先，此标志物在并非高度心肌特异性，在肌肉与骨髓严重损伤时也会有所升高。实际上，骨骸肌也含有CK-MB，这样手术和外伤也会影响CK-MB的水平。其次，更为重要的是，CK-MB的早期释放时相也限制了它在心肌梗死疾病中的应用。因为时间区段比较狭窄，CK-MB可用于再次梗塞的诊断是很明确的［1、2、3］。
现已证明肌红蛋白在心肌损伤的早期就被释放进入血液循环。但是肌红蛋白并非心肌特异性的。最主要的假阳性源于肾功能衰竭和骨髂肌的疾病。肌红蛋白的升高比任何其它传统的项目都要早1个小时，并可有效地排除AMI。肌红蛋白作为AMI 标志物的另一个缺点是诊断窗口期短，它在AMI发生后24 小时即恢复到正常水平。
肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌钙蛋白的亚单位，具有高度的特异性，在AMI发作的早期(3～6 h)即可在血清中出现，有最宽的时间范围：cTnT为5-10天，cTnI为4-10天，在此阶段，肌钙蛋白升高的程度比CK-MB的参考标准还要高5-10倍。因为它们的心肌特异性高以及在正常人体之中血清浓度很低，心肌肌钙蛋白对微小心肌损伤有更高的敏感性，被认为是较CK-MB更优秀的AMI 标志物。不少研究者发现，cTnT在肾功能衰竭、肺部疾病、骨骼肌损伤时也升高［4、6、7］。因此，从早期诊断、灵敏度、特异性和诊断时间窗口四个方面考虑，cTnI是目前效率最高的AMI 标志物，并导致了一个新的诊断述语 “微小心肌损伤” 的出现。
在新的标准中，生化标志物在AMI的诊断中占有重要的地位。这主要是由于新的极为灵敏和精确的心肌损伤标志物的发现，以及胶体金技术在床旁检验的应用，使得临床医生可以及早发现早期的不典型患者，甚至于可以在家里实施床旁检验，自我检测，早期治疗。
而将试纸条法用于心肌梗死诊断的时间并不长。1996年Boehringer Mannheim Corp向市场投放了肌钙蛋白T快速诊断试剂盒。1997年和1998年加拿大司派克诊断公司向市场投放了肌红蛋白/肌钙蛋白I 诊断试剂盒和肌红蛋白/CK-MB/肌钙蛋白I 诊断试剂盒［8、9、10］。这几种试剂盒在国内均有进口，但由于价格较高，尚未普遍被国内医疗部门广泛采用。
美国、加拿大等国家研制了胶体金法急性心肌梗死早期诊断试剂盒，用于检测血液中的CK-MB和cTnI的含量。该试剂盒检测仅需15分钟，在发病3小时内（约就诊时）的阳性检出率可达60%，4小时以后阳性检出率达96-100%［8、9、10］。这些诊断试剂盒的上市对美国、加拿大地区的急性心肌梗死患者的诊断和治疗起很大的推动作用，不仅节约了大批可疑病例就诊期间的监护费用，而且大大改善了急性心梗病人的预后。因此，尽快研制我们国家自己的急性心肌梗死诊断试剂盒具有很重要的现实意义。
冠心病是影响人群健康的主要疾病。欧美等西方国家冠心病及其它心血管系统疾病于二十世纪已成为人群的第一死因。美国每年约有急性心肌梗死患者200多万，虽然其医疗水平很发达，但仍有15-25%的病例死于心梗。在其所有疑视急性心肌梗死患者中，只有15-20%的病例最终确诊为心肌梗死，其中80%以上的非心肌梗死病人也要入院进行监护，以排除心肌梗死的诊断。美国每年用于冠心病人的诊治费用约950亿美元。在我国人群中虽然冠心病不是第一死因，但近几年的统计也表明，它是仅次于脑血管病的第二杀手。全国每年大约有1500万伴有胸痛的患者以急性心肌梗死可疑病例入院，其中只有30%左右的患者最终被确诊为心肌梗死。
该试剂盒不仅快速，而且操作简便，可用于包括卫生院和乡村诊所的各级医疗服务部门。因此，该产品的研制及上市可使许多心电图呈非典型性或变化不明显的心梗患者及时确诊，不仅可改善心梗患者的预后，还可显著降低可疑病例的临床观察给病人及有关部门造成的巨大经济负担。

2．产品的描述：
2.1 产品所采用的技术原理：
本试剂采用双抗体夹心法免疫测定原理，用胶体金标记抗人心肌肌钙蛋白I（cTnI）单克隆抗体作为显色剂，用配对的非标记抗人cTnI多克隆抗体作为捕获剂，用非标记羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控剂，以固相硝酸纤维膜作为载体，应用纸层析式双抗体夹心法的原理定量检测血液中心肌肌钙蛋白I水平。采用胶体金免疫层析定量分析仪可具体分析心肌肌钙蛋白I的含量。
2.2主要原材料来源及制备方法：
2.2.1 血细胞血浆分离膜
来 源：杭州韩感科技有限公司(印度Advanced Microdevices PVT,LTD公司)
质控方法： A）血细胞血浆分离膜各层是否干燥、有无湿水。
B）血细胞血浆分离膜各层是否整齐、完整。
C）血细胞血浆分离膜外观尺寸是否符合要求。
2.2.2 硝酸纤维素（NC）检测膜
来 源：杭州韩感科技有限公司
质控方法：A）NC检测膜内包装密封是否完整。
B）NC检测膜各层是否有破损。
C）NC检测膜尺寸是否符合要求。
2.2.3 抗人肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗人肌钙蛋白I多克隆抗体
来 源：美国 Genagates 公司
质控方法：A）澄清度：在４℃条件下解冻复温，观察抗体溶液的澄清度，如有沉淀析出则视为不合格。
B）浓度：每一样品取适量，用Lowry’法或分光光度法测定抗体蛋
白浓度。以测得的蛋白浓度与标定浓度的误差在10%以内为合
格，否则视为不合格。
C）纯度： SDS-PAGE检定，取10ug的蛋白，用考马斯亮兰R250染
色应只含25KD和50KD 两条蛋白带。
D）活性：
a、胶体金溶液标记单克隆抗体，标记抗体的初始浓度为10ug/ml。
b、用PBS稀释羊抗人肌钙蛋白I多克隆抗体至1mg/ml，取已制备的空白检测试纸条，向NC检测膜上用微量加样器点加羊抗人肌钙蛋白I多克隆抗体，向血细胞血浆分离膜远离检测膜的部位点加标记后的抗人肌钙蛋白I单克隆抗体，37℃干燥3小时。
c、取出试纸条，放入测试盒内，向样品槽滴加肌钙蛋白I浓度为1.0ng/ml的标准阳性样品，以抗人肌钙蛋白I多克隆抗体点样部位出现显色为合格。
2.2. 4 羊抗鼠IgG多克隆抗体
来 源：美国 Genagates 公司
质控方法：A）澄清度：在４℃条件下解冻复温，观察抗体溶液的澄清度，如
有沉淀析出则视为不合格。
B）浓度：每一样品取适量，用Lowry’法或分光光度法测定抗体蛋
白浓度。以测得的蛋白浓度与标定浓度的误差在10%以内为合格，
否则视为不合格。
C）纯度： SDS-PAGE检定，取10ug的蛋白，用考马斯亮兰R250
染色应只含25KD和50KD 两条蛋白带。
D）活性：
a、胶体金溶液标记抗人肌钙蛋白单克隆抗体，标记抗体的初始浓为
10ug/ml。标记后的抗体胶体金溶液用分光光度法测定OD530吸光值大
于3.500。
b、用PBS稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体至1mg/ml，取已制备的空白检测试纸条，向NC检测膜上用微量加样器点加羊抗鼠IgG多克隆抗体，向血细胞血浆分离膜远离检测膜的部位点加标记后的抗人肌钙蛋白单克隆抗体，37℃干燥3小时。
c、取出试纸条，放入测试盒内，向样品槽滴加阴性样品，以羊抗鼠IgG多克隆抗体点样部位出现显色为合格。

2.3 主要生产工艺过程:
2.3.1 用10%氯化金溶液和10%柠檬酸三钠溶液反应制备颗粒大小为40nm的胶体金。
2.3.2 1ml胶体金中加0.2MK2CO3 3.5ul调胶体金PH值，标记抗人肌钙蛋白I单克隆抗体，用10%BSA封闭30min后离心，弃掉上清，用胶体金缓冲溶液溶解，放4℃保存备用。
2.3.3 将抗人肌钙蛋白I单克隆抗体金标液均匀地喷涂在金标垫上。烘干后密封保存备用。
2.3.4 包被羊抗鼠IgG多克隆抗体和羊抗人肌钙蛋白I多克隆抗体在NC膜上，烘干后密封保存备用。
2.3.5 在湿度小于30%，温度小于28℃的环境中组装试剂板。将吸水纸、滤血膜、金标垫、上样垫贴于PVC板上的相应位置。
2.3.6 将试剂板切割成4.0mm宽的试剂条，制定标准曲线，将试剂条装于塑料扣卡中即为试剂盒。
2.3.7 将干燥剂、试剂盒、塑料滴管装入铝箔袋中，封口。
2.3.8 将产品装在包装箱。

2.4 质控品、标准品（校准品）的制备方法
2.4.1 阴性样品的制备：用健康人血清作为阴性样品。
2.4.2 阳性样品的制备：
使用外购的心肌钙蛋白I含量为50ng/ml的标准品，用配套的稀释液稀释使其中心肌钙蛋白I含量达到所需浓度。
2.4.3 上述阳性样品及阴性样品分别分装于500ul小管中在冷冻状态（-70℃）下保存，可保存9个月。

3．有关生物安全性方面的说明：
本品不含毒性物质、过敏性物质、突变性物质、致畸性物质、致癌性物质、致热性物质不存在微生物污染和交叉感染问题，所使用的原材料均符合《中国药典》2010版的规定。本品所含的化学成份均符合《中国生物制品规程》2000版要求，本试剂盒中所用的主要原材料抗人肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗人肌钙蛋白I多克隆抗体都是外购，在产品的运输、使用过程中对接触和环境不会造成任何危害。

4．产品主要研究结果和评价：
4.1 主要研究结果的总结
4.1.1单克隆和多克隆抗体的配对研究
抗人肌钙蛋白Ｉ单克隆抗体和羊抗人肌钙蛋白Ｉ多克隆抗体配对以检测血液肌钙蛋白Ｉ水平。我们以胶体金标记的单克隆抗体作为指示抗体，以多克隆抗体作为捕获抗体，制备免疫层析试纸条。
4.1.2 半成品的研究
我们经过反复试验，确定了胶体金颗粒大小，胶体金标记所用单克隆抗体最佳浓度，多克隆抗体印膜最佳浓度，同时对硝酸纤维素检测膜，玻璃纤维素胶体金吸附膜，血浆血细胞分离膜以及吸水膜垫等进行了试验。结果发现用于肌钙蛋白Ｉ检测的胶体金标记颗粒以40nm为宜，待标记单克隆抗体浓度 10µg/ml即达反应平台，多克隆抗体印膜浓度为1mg/ml。经过反复筛选如下材料达到了我们检测要求：硝酸纤维素检测膜采用杭州韩感科技有限公司(MILLIPORE公司)HFB13502；玻璃纤维素胶体金吸附膜为杭州韩感科技有限公司S08；血浆血细胞分离膜由杭州韩感科技有限公司(印度Advanced Microdevices PVT,LTD公司)提供，为WRF-10070071全血分离膜，吸水膜垫、塑料扣卡、PVC底片为杭州韩感科技提供，透明不干胶带则为市售产品。我们利用上述条件制备的试剂盒肌钙蛋白I其最低检测值为1.0ng/ml，与肌红蛋白、CK-MB无交叉反应，同时其测试结果也不受血液白蛋白、胆固醇和游离胆红素等的影响。

4.2 对该产品的评价：
本品采用肌钙蛋白Ｉ单克隆抗体，肌钙白Ｉ多克隆抗体，应用双抗体夹心一步法原理，以胶体金作为指示标记，交联肌钙蛋白Ｉ单克隆抗体，肌钙蛋白Ｉ多克隆抗体作为捕获抗体，分别与血液中的肌钙蛋白Ｉ结合并显色，从而定量检测血液中肌钙蛋白Ｉ的水平。
肌钙蛋白Ｉ是重要的心肌组织损伤特异性标志物，临床广泛用于急性心肌梗死及其它心肌损伤性疾病的辅助诊断，因此，该试剂盒通过定量检测病人血液中肌钙蛋白Ｉ浓度是否升高，可为临床医生提供一重要的急性心肌梗死辅助诊断手段。

4.3 与同类产品的比较研究：
南京基蛋生物科技有限公司是国内较早研制该产品，并在国内有注册产品文号的公司 [苏食药监械（准）字 2010 第 2400743 号（更 2012-202）]。该产品以其可靠的质量临床广泛用于急性心肌梗死的辅助诊断。我们以该试剂盒作为参比品，进行了产品质量的对比研究。结果在我们的试剂盒加样后15分钟时和该公司的试剂盒加样后 15分钟内（说明书要求），其检测结果一致，其最低检出量和检测特异性等也均一致。在本次临床实验工作中与其做对照品进行比较（见临床报告）基本一致。

4.4 产品的稳定性研究：
按照国家药品监督管理局体外诊断用品申报的有关规定，我们对我们的试剂盒进行了 37℃加速条件的试验。结果表明：本品在37℃下存放20天的检测结果也与0天的结果一致。

4.5产品CUT OFF（最低检出量） 值的建立：
以已获得药监部门批准上市并获得了市场的广泛认可的南京基蛋生物科技有限公司建立的最低检出量作为本产品的最低检出量建立的依据，正常参考值上限取第99百分位点为1.0ng/ml；＜1.0ng/ml为正常，≥1.0ng/ml为升高。使用胶体金免疫层析定量分析仪进行检测时，本试剂盒检测范围为1~50ng/ml。当样本中cTnI的含量高于50ng/ml时，测定结果“>50ng/ml”，低于1.0ng/ml时，测定结果“＜1.0ng/ml”。

5．国内有关该产品的专利检索情况
经中国专利检索，未发现有相同的专利在中国批准或申报。检出5篇相关专利文献，文献CN102841208A，题为“ 快速检测肌钙蛋白I的胶体金试纸及其制备方法”，已于2012.12.26公开，该文献采用BSA\PEG单克隆抗体增加其显色，检测心肌肌钙蛋白Ｉ的含量。而本项目采用双抗体夹心，胶体金一步显色检测肌钙蛋白Ｉ含量，因此，该专利文献所述权利要求不影响本技术的新颖性。
文献CN102520193A，题为“定量检测人心肌肌钙蛋白I的荧光免疫层析方法及其试剂盒”，于2012.06.27公开，该专利文献利用荧光免疫层析方法检测样品肌钙蛋白I的水平，本技术利用胶体金一步法检测心肌肌钙蛋白Ｉ水平。因此，该文献不影响本技术的新颖性。
文献CN102426246A，题为“人肌钙蛋白I(Troponin I)定量测定试剂盒及其检测方法”，于2012.04.25公开，该专利的主要特征为化学发光技术与免疫磁微粒相结合用于肌钙蛋白Ｉ检测。同样该文献不影响本技术的新颖性。
文献CN102192986A，题为“心肌肌钙蛋白I的检测试剂及其制备方法和用途”于2011.09.21公开。该专利文献阐述特点是该检测试剂为有机硅包裹的纳米金微粒用于免疫金标检测的试剂盒，因此，该文献不影响本技术的新颖性。
文献 CN101059519，题为“ 心肌肌钙蛋白I纳米金标检测试纸条及其制备方法”，该专利文献采用3株可互相配对形成夹心的抗人cTnI单克隆抗体，其中2株作为捕捉抗体，1株作为显色抗体； 用15～25nm纳米金颗粒标记显色抗体进行检测的技术，本技术采用双抗体夹心胶体金显色法胶体金60nm，因此，该文献不影响本技术的新颖性。

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