圆盘电泳.pptx

高级生物化学技术高级生物化学技术中山医学院中山医学院中山医学院中山医学院生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室实验一实验一 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：注意事项：n n丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（C、D）是是神神经毒性经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。用完加盖用完加盖。n nTEMED（A、B）要密封保存，要密封保存，用完加盖用完加盖。n n过硫酸铵过硫酸铵（G）溶液最好新鲜配制，以防止溶液最好新鲜配制，以防止氧化失效。氧化失效。用完加盖用完加盖。n n核黄素核黄素（E）需避光保存。需避光保存。主要过程主要过程n n凝胶柱的制备凝胶柱的制备n n加样加样n n电泳电泳n n剥胶剥胶n n固定和染色固定和染色n n漂洗漂洗1 1凝胶玻璃管的准备凝胶玻璃管的准备凝胶玻璃管的准备凝胶玻璃管的准备（封口）（封口）（封口）（封口）2 2分离胶的制备分离胶的制备分离胶的制备分离胶的制备3 3浓缩胶的制备浓缩胶的制备浓缩胶的制备浓缩胶的制备4.4.装柱装柱装柱装柱实验分组实验分组（每人做一管，每（每人做一管，每3-5人配一份胶）人配一份胶）认清试剂认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）（试剂和吸管对号、量器的使用）封管封管分离胶配制与灌胶分离胶配制与灌胶（浓度为（浓度为6%，每组总体积为，每组总体积为10ml，灌胶高度为灌胶高度为78cm）封正丁醇封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min）浓缩胶配制浓缩胶配制（浓度为（浓度为3%，光聚合，每组总体积为，光聚合，每组总体积为4ml，灌胶高度为灌胶高度为1.5cm,留留1cm空加样）空加样）倒掉正丁醇倒掉正丁醇灌浓缩胶灌浓缩胶封正丁醇封正丁醇3 3mmmm（观察界面，判断凝固时间）观察界面，判断凝固时间）安装电泳槽安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）不漏水、除气泡）样品处理并加样（样品处理并加样（2020ulul）加加bufferbuffer电泳电泳（浓缩胶时（浓缩胶时3mA/管，分离胶时管，分离胶时2mA/管，距底管，距底1cm时停止）时停止）剥剥 胶胶固定（时间固定（时间5 5minmin）染色（时间染色（时间2 2minmin）漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮（一）（一）电泳的基本原理及相关知识电泳的基本原理及相关知识 电泳的概念电泳的概念带电粒子（胶体颗粒、离子等）在带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴定广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 电泳的基本原理电泳的基本原理主要利用分子之间的两个方面的差异来分离：主要利用分子之间的两个方面的差异来分离：分子所带电荷分子所带电荷电荷性质（电荷性质（+/-+/-）电荷数量电荷数量分子形态分子形态分子量大小分子量大小 分子的三维构象形状分子的三维构象形状 电泳分离蛋白质的原理蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点溶液溶液pH与蛋白质与蛋白质PI决定蛋白质决定蛋白质电荷性质与数量电荷性质与数量不同蛋白质分子大小和分子形状不同蛋白质分子大小和分子形状的差异的差异 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）纸电泳纸电泳醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳凝胶电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大，聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大，聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大，聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢。温度低时，聚合速度减慢。温度低时，聚合速度减慢。温度低时，聚合速度减慢。电泳的影响因素电泳的影响因素带电粒子的性质带电粒子的性质电场强度电场强度溶液的溶液的pH溶液的离子强度溶液的离子强度电渗现象电渗现象环境因素环境因素（二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳 合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法 化学合成系统化学合成系统过硫酸铵（过硫酸铵（AP）四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED）光学合成系统光学合成系统核黄素核黄素四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED）聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个不连续的三个不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应的三个效应 凝胶孔径不同凝胶孔径不同缓冲液缓冲液pH不同不同缓冲液离子成分不同缓冲液离子成分不同浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应Gly-Pro-Cl-Gly-Pro-Cl-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-Gly-Gly-Gly-pHpH为为为为8.8.3 3的电泳缓冲液的电泳缓冲液的电泳缓冲液的电泳缓冲液（Tris-GlyTris-Gly）pHpH为为为为6.76.7的浓缩胶的浓缩胶的浓缩胶的浓缩胶pHpH为为为为8.8.9 9的分离胶的分离胶的分离胶的分离胶有效泳动率：有效泳动率：有效泳动率：有效泳动率：MMClCl-MMProPro-MMGlyGly-Gly-Gly-Gly-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-快离子快离子ClCl慢离子慢离子GlyGlyGlyGlypK1=3.24pK1=3.24pIpI6.06.0pK2=9.7pK2=9.7 （三）、实验结果的分析（三）、实验结果的分析 相关理论表表表表-1-1-1-1 血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性种种 类类分子量分子量(万）万）PIPI分分 布布(%)(%)清蛋白清蛋白 1-1-球球蛋白蛋白 2-2-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白6.96.95.05.09.09.013.013.011.011.06.16.17.37.36.86.87.67.68.08.055552.130.82.130.84.172.54.172.51.2251.22515.615.6 前清蛋白前清蛋白 清蛋白清蛋白 2-2-球球蛋白蛋白 1-1-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白-球球蛋白蛋白