广州市售豆制品转基因成分的检测与分析.pdf

2 01 4 Ve 1 3 3 NO9 1 3 8 S e r i a l N o 2 7 1 Chi n a Br e wi n g A n a l y s i s a n d E x a mi n a t i o n 广州市售豆制品转基因成分的检测与分析 黄靖，何敏恒z，许喜林(1 华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州 5 1 0 6 4 0；2 广州质量监督检测研究院 国家加工食品质量监督检验中心(广州)，广东 广州 5 1 0 1 1 0)摘要：为了解广州市市售豆制品的转基 因情况，对广卅 I 市售散装豆制品和预包装豆制 品分别进行抽样检验。采用改良十六烷基三 甲基溴化铵(C T AB)法提取大 _ D NA，利用核酸定性P C R、实时荧光P C R 及环介导等温扩增技术(L AMP)对外源基 因C a MV 3 5 S，NO S 和E P s 拄 行检测。调查共抽检豆制品2 0 7 份，研究结果表明，在检测的1 5 9 份散装豆制 品中，8 7 份检 出转基因成分；在4 8 份预包装豆 制 品中，l 8 份检出转基因成分。散装豆制 品无任何食品标签，而预包装豆制 品均无转基 因食品标识。关键词：豆制品；转基因；C a MV 3 5 S 因；NO s 基因；E P 5 lP s 基因 中图分类号：$5 6 5 1 文献标识码：A 文章编号：0 2 5 4 5 0 7 1(2 0 1 4)0 9 0 1 3 8 0 5 d o i：1 0 1 1 8 8 i s s n 0 2 5 4 5 0 7 1 2 0 1 4 0 9 0 3 3 De t e c ti o n a n d an a l y s i s o f g e n e t i c a l l y mo d i fi e d i n g r e d i e n t s in s o y b e an p r o d u c t s in Gu a n g z h o u HUANG J i n g ，HE M i n h e n g 2，XU Xi l i n (1 C o l l e g e o f L i g h t I n d u s t r ya n dF o o d S c i e n c e s,S o u t h C h i n a U n i v e r s i tyo f T e c h n o l o g y,G u ang z h o u 5 1 0 6 4 0,C h i n a；2 G u a n g z h o u Q u a l i tyS u p e r v i s i o nand T e s t i n gI n s t i t u t e,N a t i o n a l C e n t r e f o r Q u a l i tyS u p e r v i s i o n a n d T e s t i n go f P r o c e s s e d F o o d(Gu ang z h o u),O u ang z hnu 5 1 0 1 1 C h ina)Ab s t r a c t：T h e s o y b e a n p r o d u c t s i n b u l k an d p r e p a c k a g e d we r e inv e s t i g a t e dt o u n d e r s tan dt h e s t a t u s o f g e n e t i c a l l y mo d i fi e d f o o d in Gu an g z h o u By i mp r o ve d c e t y l t r i me t hy l a mmo ni u m b r omi d e d i n t me t h o d，g e n o mi c DNA i n t h e s a mpl e s wa s e xt r a c t e d Th e e x o ge no u s g e n e s uc h a s Ca M V3 5 S,NOS a n d EP S P S we r e d e t e c t e d o n the s a mp l e s b y n u c l e i c a c i d，r e a l t i me fl u o r e s c e n c e Qu a l i tat i v e P CR and l o o p me d i a t e d i s o t h e r ma l a mp l i fi c a t i o n I n t o t a l 2 07 s a mpl es the r e s u l t s s h o we d that 8 7 o f 1 5 9 s o y b e an p r o d uc t s in bu l k a n d 1 8 o f48 pr e pa c k a g e d s o y be a r l p r o d uc t s c o n tai ne d ge ne t i c a l l y mo d i fie d i n g r e di e n t s The s o y be a r l p r o d uc t s i n bu l k h a d n o p a c k a g e an d f o o d l a b e l，an d s o y be an p r o d uc t s i n pr e pa c ka g e d ha d n o l a be l o f g e ne t i c a l l y mo d i fie d o r g a n i s m Ke ywo r ds：s o y b e a r l p r od u c t s；t r a n s ge ne；Ca M V35 Sg e ne；NOSg e n e；EPS PSg e ne 1 9 9 6 年开始，转基因作物在全世界开始了商业化种植，在随后的l 8 年得到迅速的推广，2 0 1 3 年全球共有2 7 个国家 商业化种植转基因作物，种植面积达到1 7 5 2 x 1 0 s l n z 1 。海关统计数据显示，我国2 0 1 3 年累计进 口大豆6 3 8 3 万t，与 2 0 1 2 年 比较增长了8 6，已成 为全球最大 的大豆进 口国【2】。我 国是最早研发生产 豆制 品的国家，各种豆制 品美 味 可 口，营养健康，广受消 费者欢迎。根据我 国的(转基 因食 品卫 生管理办法 和 农业转 基 因生物 标识管理 办法，销 售的食品若含有转基因成分，应该予 以标识，但实际生活 中，很多产 品都 未按照规 定进行标识，而进入 加工的转基 因原料更难 以进行 有效监 管。叶可萍等3】利用T a q Ma n 探针 实 时荧光P C R 技术 在市售 肉制 品检 测是 否转基 因大豆 成 分，结 果显示 在抽取 的 1 9 份样 品 中，其 中7 份 的外源 基 因 C a MV 3 5 S 启动子检测结果为阳性，5 5)样品检测出含有外 源基 因R R S。外 源核酸 的测 定是 目前最 常用 的转基 因食 品检测方 法，环介导等温扩增技术(1 o o p me d i a t e d i s o t h e r ma l a mp l i fi c a t i o n，L A MP)4-5 作为一种新的核酸检测技术受到越来 越多关注，并且逐步被应用于病毒检测、细菌检测、转基因 食品检测等多方面，并且许多学者的研究结果表明，L A MP 的灵敏度 比普通P C R高一个数量级 以上 6-9 。G U A N X 等 于 2 0 1 0 年 己成 功 利 用 L A MP 技 术 实 现 对 G T S 4 0 3 2 和 MO N8 9 7 8 8 这两个转基 因大豆品系的特 异性检测。为了解广州市市售豆制品的转基 因情 况，对 广州市售 的散装豆制 品和预包装 豆制 品分别进行抽检，其中散装豆 制品包括豆腐、豆干、油豆腐、腐竹4 种，预包装豆制品包括 支竹和腐乳2 种。另外，为了比较核酸定性P c R，荧光实时 P C R及L AM P 技术3 种检测方法的有效性，对样品用改 良 C T A B 法进行D N A提取后，用上述3 种检测方法对3 对外源 基因 c a ，5 S、NO S 和E P S P S 分别进行 检测，从而 比较得 收稿 日期：2 0 1 4 0 7 2 6 基金项 目：广东省农业攻关科技计划项 目(2 0 1 2 B 0 2 0 3 1 1 0 0 2)作者简介：黄靖(1 9 8 5 一)，女，工程师，硕士研究生，研究方 向为食品检测。+通讯作者：许喜林(1 9 6 4 )，男，副教授，博士，研 究方 向为食品质量控制。分析与检测 中 国 酿造 2 0 1 4 年第3 3 卷第9 期 总第 2 7 1期 1 3 9 出检测 方法 的有效性。1材料 与方法 1 1材料与试剂 1 1 1样 品 实验样品分为散装豆制品与预包装豆制品两大类，散 装豆制品包括豆腐、豆干、油豆腐、支竹4 种豆制品，预包装豆 制品包括支竹、腐乳2 种豆制品，均从市场上购买，散装豆制 品中豆腐样品6 3 份，豆干样品4 8 份，油豆腐样品3 6 份，支竹 样品1 2 份，预包装豆制品中支竹样品3 0 份，腐乳样品l 8 份。阳 性 对 照 为 带 有 E P S P S 外 源 基 因 的 转 基 因 大 豆 GT S 4 2 3 2：广东省出入境检验检疫局实验室提供。阴性 对照为非转基因大豆，由市场购买，经检测确认后使用。1 1 2试剂 1 0 mo l L Na O H：广 州 化 学试 剂 厂；1 mo l L T r i s H C 1 (D H 8 0)：上海生工生物工程技术服 务有 限公司；乙二胺 四 乙酸(e t h y l e n e d i a mi n e t e t r a a c e t i c a c i d，E DT A)溶液(p H 8 0)、抽提液【“】、裂解液 1 1】，T r i s D E T A缓冲液(p H 8 0)，5 0 x T A E 缓冲溶液：上海生工生物工程技术服务有限公司；琼脂糖：英 国O X O I D 公司；核酸定性P C R 反应试剂(1 0 x P C R b u ff e r，d NT P s，Mg C I 2，T a q D N A p o l y me r s e，Ma r k e r D L 2 0 0 0)、实 时荧 光定量P C R反应试剂(1 0 x P C R b u ff e r，d NT P s，Mg C I 2，E x T a q D NA p o l y me r s e)：大连宝生物有 限公司；L A MP 反应 试 lJ(B s t D NAp o l y me r a s e l a r g e f r a g me n t，d N T P s)：美 国Ne w E n g l a n d B i o l a b s 公司；引物序列(P AG E)：上海英骏生物技 术有 限公司。1 2仪 器与设备 S a r t o r i u s B T 1 2 4 S 电子天平：德 国S a a o fi u s 公 司；Mi l l i p o r e S y n t h e s i s A1 0 超纯水器：美Mi l l i p o r e 公司；F O S S 均质 磨H o mo g e n i z e r 2 0 9 4：丹 麦F O S S 公 司；I K A AI 1 b a s i c分析 研 磨机：德 国I K A公 司；一恒DK 8 D电热恒温水浴锅：上海 一恒科学仪器有限公司；H e r ml e Z 2 3 3 MK-2 台式冷冻离心 机：德 国H e r ml e 公 司；H i r a y a ma MM 5 2 2 0 2 0 0 高压 蒸汽灭 菌器：日本Hi r a y a ma 公司；B I O R AD S ma r t S p e c P l u s 核酸 蛋 白分析仪：美 国B I O R A D公司；B i o me t r a T 3 0 0 0T h e r mo c y-c l e r P C R仪：德 国B i o me t r a 公司；B I O R A D P o w e r P a c B a s i c 电泳仪、B I O R A D凝胶成像系统：美国B I O R A D公司；A B I 7 3 0 0 R e a l T i me P C R S y s t e m实时荧光定量P C R 仪：美 国A B I 应用生物系统公司。1 3 方 法 1 3 1大豆基 因组D NA 提取 样 品使用搅拌机粉 碎均匀，称取2 0 0 0 mg 加入离心 管 中，每个样 品取2 个平行。采用 改 良C T A B 法提 取大豆基 因组D NAt“】，将提取 得 到的D NA取5 L，稀释 1 0 倍，用核酸蛋 白分析仪测量O D 值，若O D 瑚 O D 瑚 介于1 8 2 0 之 间，D N A质量浓度达 U 2 0 0 n L，则基本能满足P C R 检测需要。1 3 2核酸定性P c R 检测 将得到D N A进行核酸定性P C R 检 测，分别对外源基因 C a MV 3 5 S、N OS N 目)s P s 进行扩 增。核 酸定性P C R 引物序 列，反应体系及反应循环参数参照中华人民共和国出入境 检验检疫行业标准S N T 1 2 0 2-2 0 1 0(品中转基 因植物成 分定性P C R 检测方法【2 及S N T 1 1 9 5-2 0 0 3 大豆中转基 因成分 的定性P C R 检测方法 13】。取5 L 扩增产物于1 琼脂糖凝胶中检测，溴化乙锭 染色，以D L 2 0 0 0 作 为D N A分 子质 量标记，8 0 V恒压 电泳 4 0 mi n。用凝胶成 像系统 观察、记录结 果，C a MV 3 5 S目的 基因片段为 1 9 5 b p，N O S目的基 因片段 为1 8 0b p，E P S P S 目 的基 因片段为3 2 0 b p。1 3 3实时荧光P c R 检测 将得到DN 挂 行实时荧光P c 贩 应，分别对C A MV 3 5 S,N0 s 和E P s P s 外源基 因进行扩增。实 时荧光P C R 引物序列，反应体系参照中华人 民共和国出入境检验检疫行业标准 S N T 1 2 0 2-2 0 1 0 食品中转基因植物成分定性P C R检测 方法 1 2 1 和S N T 1 2 0 4-2 0 0 3 植物及其 加工产 品中转基 因 成分实时荧光P C R 定性检验方法 1 4】。1 3 4 L A MP 检测 将得 IJ D NA 进 行L A MP 反应 15】，分别对 C A 仉 3 5 S【、N O S t l 5：1 E P S P S 1 7#t 源基 因进行扩 增。L AMP 检 测 引物序 列及反应体系分别如表 1、表2 所示。表1 L AMP引物序列 Tab l e 1 Pr ime r s eq u en c e o f L AMP 基因 引物名称 引物序列(5 -3 )C-F 3 a g g a a gg t c t t g c g C-B3 a t a a a gg a a a g g c c at c g Ca M v3 5 s C FI P g t ct t c a a ag c aa g t g g tt t t g g at a gt g gg a tt g t g c g C BI P t c c a c g a t g c t c c t c g t t t c t c t g c c g a c a g t g g N-F3 c t c g t t c a a a c a t t t g g c a N B3 g c g c t at a t t t t g t t t t ct a t c g Nos N F I P a c at g ct t a a c gt a aRe a a ca g a a g at t g a a t c c t g t t g c c g N BI P t g ca t ga c gt t at t t a t ga g at g gc g t a r t a a at g t a ta a r t g c gg g a E F 3 c c t a c a a a t g c c a t c a t t g c g E B3 a g ag g aa g gg t ct t g c g a a EPs P s E-F I P t c t t c t t t t t c c a c g a t g c t c c t c g a t c g t t g a a g a t g c c t c t g c E BI P c g tt c c a a c c a cg t ct t c a a ag c g a t ag t gg g at t gt g cg t c a t L AMP 反应条件：将反应混合物在6 5 孵育6 0 mi n，最 后8 0 加热 1 0 mi n 终止反应 1 5 。取5 L 扩增产物于l 琼脂糖凝胶中检测，溴化乙锭染 色，以D L 2 0 0 0 作为D NA 分子量标记，8 0 V 恒压电泳6 0 mi n。用凝胶成像系统观察、记录结果。2 0 1 4 Ve 1 3 3 No 9 1 4 2 S e r i a l N o 2 7 1 Chi n a Br e wi n g An a l y s i s a n d E x a mi n a t i o n 量较多，其中腐乳的含油量和杂质最高，D NA 提取有一定 困难，提取得到的D NA 纯度较低，且D N A片段较为零碎。实时荧光P C R 法 的适用范 围正是此类深 加工食品，而核酸 定性P C R法则会由于样品D N A的纯度较低及片段零碎无 法扩增 出特 异性 目的片段，从而得 到阴性 的结果。L A MP 实验方法作为一种非标准方法，检出率在5 类豆 制品中均与核酸 定性P C R 方法接近，略高于核酸定 I P C R 方法。对于豆腐和豆干这两类样品，由于D N A片段完整，L A MP 实验方法具有较高的灵敏度，因此阳性比率高于核 酸定性P C R 法和实时荧光P C R 法；对于油豆腐、支竹和腐 乳这三类样品，由于D N A 片段零碎，L A MP 实验方法的引物 片段较长，也容易导致无法有效扩增，得到阴性结果，因 此阳性 比率要低于实时荧光P C R 法。4结论 本次调查共抽检豆制 品2 0 7 份，其中散装豆制 品1 5 9 份，检 出转基 因成分样 品8 7 份，抽取预 包装豆制 品4 8 份，检 出 转基因样品l 8 份，表 明转基 因豆制 品 已有相当高的市场 占 有率。虽然我国并未批准商业化种植转基因大豆，转基因 大豆的来源绝大部分是通过进口的，且农业部规定转基因 大豆只能用于制备食 用油，但 由于进 口转基因大豆与国产 非转基 因大豆相 比，在价格与质 量上都有 一定的优势，而 豆制品的销售价格比较便宜，部分的豆制品生产者可能为 了进一步降低成本，或由于对原料把关的不严格，购买进 口转基因大豆作为原料用于生产各种豆制品，导致转基因 豆制 品大量流入市场。本研究抽检的豆制品中，散装豆制品无包装，因此无 任何食 品标签，而预包装豆制品中标注转基因食品的为零。因此 可 以看 出，尽 管我 国实 施转基 因食 品标 识制 度 已有 一段时间，但 目前市售预包装豆制品中仍有许多产品未贯 彻执行，如何实施监督将转基因标识制度落实将是一大难 题。另一方面，更为严峻 的 问题在于转基 因大豆 作为原料 进 口后，加工制成 的散装食 品该如何监管，如何让 消费者 拥有更多的知情权与选择权，仍然是今后转基因食品监管 要面临 的重要 问题。参考文献：1】C L I VE J Gl o b a l S t a t u s o f C o mme r c i a l i z e d Bi o t e c h GM C r o p s E B O L】(2 0 1 3)h t t p：ww wi s a a a o r g 2 海关 信息网 2 0 1 3年 我国进 口大 豆检测报 告 E B O L (2 0 1 3)h tt p：WWW h a i g ua n i n f o 【3】叶可萍，祝长青，周光宏 利用 T a q Ma n实 时荧光 P C R检测市 售 肉制 品中转基 因大豆成分【J】食 品与发酵工业，2 0 1 0，3 6(1 2)：1 6 0 1 6 4 【4】NOT O MI T，OK AYA MA H，MAS U BU C HI H，e t a 1 L o o p me d i a t e d i s o t h e r ma l a mp l i fi c a t i o n D NA J Nu c l e i c Ac i d s R e s,2 0 0 0，2 8(1 2)：e 6 3 5】MOR I Y，N AGA MI N E K，T OMI T A N，e t a 1 De t e c t i o n o f L o o p-me d i a t e d i s o t h e r m a l am pl i fic a t i o n r e a c t i o n b y t u r b i d i t y d e riv e d f r o m m a g n e-s i u m p y r o p h o s p h a t e f o rma t i o n J Bi o c h e m B i o p h R e s Co，2 0 0 1，2 8 9(1)：1 5 O 1 5 4 【6 NA KAUC H I M，YOS H I K AWA T，NA KAI H，e t a 1 E v a l u a t i o n o f r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n l o o p me d i a t e d i s o the r ma l a mp l i fi c a t i o n a s s a y s f o r r a p i d d i a g n o s i s o f P a n d e mi c in f u e n z a A H1 N1 2 0 0 9 v i r u s J J Me d Vi r o i 2 0 1 l，8 3(1)：1 0 1 5 7】F U KUMA A，K UR OS AKI Y，MOR I K AWA Y，e t a 1 R a p i d d e t e c t i o n o f L a s s a v i r u s b y r e v e r s e t r a n s c rip t i o n l o o p me d i a t e d i s o the r ma l a mpl i f i c a t i o n J Mi c r o b i o l I mmu n o l，2 0 1 l，5 5(1)：4 4 5 0 8 Y UK I KO H I(N E MOT O J，O HT S UKA e t a 1 S e n s i t i v e and r a p i d d e t e c t i o n o f Ve r o t o x i n-p r o d u c i n g Es c he r i c h i a c o l i u s i ng l o o p me d i a t e d i s o the rm a l a mp l i fi c a t i o n J J Me d Mi c r o b i o l，2 0 0 7，5 6(3)：3 9 8-4 0 6 【9 X U z，L I L CH U J，e t a 1 De v e l o p me n t a n d a p p l i c a t i o n o f l o o p-me d i a t e d i s o t h e rm a l am p l i fic a t i o n a s s a y s o n r a p i d d e t e c t i o n o f v a r i o u s t y p e s o f S ta p h y l o c o c c i s t r a i n s J F o o d Re s l n t，2 0 1 2，4 7(2)：1 6 6 1 7 3 【1 0】G UA N X，GUO J，S HE N P，e t a 1 Vi s u a l and r a p i d d e t e c t i o n o f t w o g e n e t i c a l l y mo d i fie d s o y b e an e v e n t s u s i ng l o o p me d i a t e d i s o t h e rm a l a m p l i fi c a t i o n me t h o d J F o o d An a l Me t h，2 0 1 0，3(4)：3 1 3-3 2 0 【1 1 柳毅 环 介导等温扩增技术快速检测转基因大豆的研究【D】保定：河北农业大学硕士论文，2 0 0 9 【1 2 中华人 民共 和 国国家 质量监督检 验检疫 总局 S N T 1 2 0 2-2 0 1 0食 品中转基因植物成分定性 P C R检测方法【S 北京：中国标准出版社，2 0 1 0 1 3 中华人 民共 和 国国家 质量监督检 验检疫 总局 S N T l 1 9 5-2 0 0 3大 豆中中转基因成分的定性 P C R检测方法【S 北京：中国标准出版社，2 0 0 3 【1 4 中华人 民共 和 国国家质 量监督检 验检疫 总局 S N T 1 2 0 4-2 0 0 3植 物及其 加工产 品中转基 因成分实 时荧 光 P C R定性 检验方法【s 北 京：中国标准出版社，2 0 0 3 1 5 沈会平 环介导等温扩增 法检 测转基 因大豆及其制 品的研 究 D 广 州：华南理工大学硕士论文，2 0 1 2 1 6 袁瑛娜，单潇潇，王宗德，等 应用 L AMP实时浊度法检测转基因大豆 J 现代食 品科技，2 0 1 1，7(1 O)：1 2 6 4 1 2 6 7