谷胱甘肽的应用及检测方法.pdf

谷胱甘肽的应用及其检测方法杨培慧,齐剑英,冯德雄,蔡继业(暨南大学 化学系,广东 广州 510632)摘 要:综述了谷胱甘肽的现状和发展前景。在食品方面,谷胱甘肽能够改善食品的风味、品质;在生物医学方面,谷胱甘肽可以保护体内细胞,维持蛋白质结构和功能,清除体内过氧化物、自由基,解毒,促进铁质的吸收,参与氨基酸的转运和吸收。同时讨论了谷胱甘肽的检测技术。关键词:谷胱甘肽;生物学功能;生理功能;含量测定;应用 中图分类号:Q516 文献标识码:A 文章编号:100521678(2002)0120052203The application of glutathione and its determinationY ANG Pei2hui,QIJian2ying,FENGDe2xiong,CAIJi2ye(Chemistry Department of Jinan University,Guangzhou510632,China)谷胱甘肽是机体内的重要活性物质,它具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能1。谷胱甘肽化学名为:N2(N2L2 2G lutamyl2L2cysteninyl)glycine,即N2(N2L2 2谷氨酰2L2半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽存在于所有的生物细胞中1,但以动物组织中含量较高,而植物组织中谷胱甘肽的含量则较低。本文对谷胱甘肽的应用及主要生理功能进行了初步介绍,以期引起人们的重视,加大对谷胱甘肽的研制开发力度,并早日实现市场化。1 谷胱甘肽的生物学功能1.1 参与氨基酸的吸收和转运小肠吸收氨基酸以及氨基酸从细胞外转运到细胞内的过程,除了借助与质膜中特异蛋白质载体系统外,谷胱甘肽也参与了氨基酸的吸收,即所谓的r2谷氨酰基循环2。该循环的大致过程为:质膜中的r2谷氨酰基催化谷胱甘肽和被吸收的氨基酸生成r2谷氨酰基酸和半胱酰甘氨酸,然后转运到细胞内,在细胞内分解成氨基酸和谷胱甘肽,这样就完成了氨基酸的转运和吸收过程。反应过程有ATP循环提供能量。1.2 维持红细胞膜的完整性、清除体内自由基红细胞在代谢过程中经常产生少量的H2O2,如不及时清除,可使细胞膜的巯基失活。H2O2还使细胞膜上的磷脂分子中不饱和脂肪酸发生氧化反应,产生脂质过氧化物,而脂质过氧化物进一步分解形成胶联剂。这些胶联剂迅速使红细胞膜遭受损伤而发生溶血。而以谷胱甘肽为底物的谷胱甘肽过氧化物酶能催化H2O2生成H2O,催化脂质过氧化物生成相应的醇,从而避免了对红细胞膜的损伤。谷胱甘肽通过自身巯基与自由基结合,从而清除体内的自由基,维持收稿日期:2001205230;修回日期:2001209218作者简介:杨培慧,(19652),女,广东汕头人。细胞的正常生长,保护细胞内含巯基酶的活性(如ATP酶),防止由于巯基的氧化而导致蛋白质的变性。谷胱甘肽有效地清除了自由基,防止皮肤老化及色素沉淀,增强皮肤光泽。同时又可减少自由基对DNA的攻击,有效地减少了DNA的损伤和突变。谷胱甘肽又是一种射线防护剂,可有效清除通过射线的直接或间接作用而在生物体内产生的高活性的各种自由基1,3。1.3 参与血红蛋白的还原作用正常人血红蛋白分子含二价铁(Fe2+),可与氧结合成为氧合血红蛋白。如果血红蛋白中的二价铁被氧化成Fe3+,即成为高铁血红蛋白(MHb),丧失运氧功能。但在正常情况下,红细胞内的谷胱甘肽与其它还原性物质(如抗坏血酸、NADH、NADPH)共同组成MHb的还原系统,能有效地防止二价铁的氧化2。2 谷胱甘肽在食品中的应用2.1 在面制品、奶制品加工中的应用在面制品加工中加入谷胱甘肽,可有效改善面团的流变特性,降低面团的强度,可较大范围地控制面团的黏度,并有效地缩短面制品的干燥时间4。据报道5,在面包焙烤中,谷胱甘肽能直接或间接地切断面筋蛋白质分子间的二硫键,从而影响蛋白质的三维网状结构和面团的流变性质,进而可以强化面包的品质和口味。在奶制品中添加谷胱甘肽和其它添加剂,可改善口味,并可最大限度的提高奶制品的品质。由于谷胱甘肽具有还原性,能起到抗氧化作用,故可有效地防止面制品及奶制品的酶促和非酶促的褐变。2.2 在肉类、海鲜类制品等食品工业中的应用由于谷胱甘肽具有优良的还原性,所以在肉类、海鲜类食品中添加谷胱甘肽,不仅可大大延长其保鲜期,还可以强化令人喜爱的口感。另外,谷胱甘肽在L2谷氨酸核酸系呈味性或与其混合物共存时,具有较强的肉类风味6。谷胱甘肽25中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2002年第23卷第1期 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/还可以防止冷冻鱼片不愉快的色变及鱼肉的褐变。在水果、蔬菜类食品中添加谷胱甘肽有利保持原有的营养和诱人的色、味,并可防止褐变。为了强化抗癌系列饮料的医疗效果,已有人申请并获得了酿造高谷胱甘肽含量的抗癌系列啤酒的专利7。3 谷胱甘肽在医学上的应用3.1 在肿瘤治疗中的应用谷胱甘肽是一种内源放射性的防护物质,它能有效地治疗机体由于肿瘤放射治疗过程中的损害8。研究人员发现,在谷胱甘肽含量较高的情况下,肿瘤的放射性治疗效果就较差,而细胞内的谷胱甘肽含量下降,虽然放射性治疗效果有所提高,但体内细胞的损伤将大大增加。因此,在肿瘤治疗过程中,如何维持细胞中谷胱甘肽的适宜含量以有效的提高肿瘤的放射治疗效果,将是今后临床医学肿瘤治疗的重要课题。3.2 作为解毒剂谷胱甘肽可直接与某些毒物结合,有效地解除外源性有毒物质(包括药物)的毒性,一般可用于丙烯腈、氟化物、一氧化碳、重金属等中毒的治疗1。同时,谷胱甘肽能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡,起到抗过衡作用。谷胱甘肽还能促进氨基酸及脂肪酸的代谢,并促进雌激素的灭活和减轻低白蛋白血症6。3.3 在临床其它方面的应用最近有报道8,谷胱甘肽具有抑制艾滋病病毒,改善性功能的功效。另外谷胱甘肽还具有治疗眼角膜病的功效。谷胱甘肽还可以向肝脏提供甘氨酸及牛磺酸,保证甘氨酸及牛磺酸型结合胆碱的合成,促进消化道对脂溶性维生素(A、D、E、K)的吸收,从而促进肝脏合成维生素K依赖性凝血因子的生成,减轻出血倾向2。有报道称,如果谷胱甘肽在体内的含量低于正常水平,将导致像糖尿病、酒精肝中毒、白内障、癌症、帕金森综合征及亚历则莫病(Alzheimer)等9一系列病症在人体的发生。3.4 在体育运动领域中的应用10美国的Salminen和Vihko报道了有关谷胱甘肽在体育方面的应用,三周的耐力训练可使小鼠体内的谷胱甘肽含量增加。经过体育锻炼,肌肉中的谷胱甘肽含量增加50%,并能提高体内血红蛋白的含量及抗氧化能力。研究人员还发现,当运动员出现最佳成绩的时侯,血红蛋白的含量都在15%以上,而血红蛋白的含量对运动员,特别对耐力项目如中长跑与马拉松运动员来说是最重要的指标。谷胱甘肽还可以保护红细胞,使其免遭破坏。因此,谷胱甘肽在运动领域中,无论是运动性贫血,还是训练过度的预防、运动营养的补充等方面的研究都是非常重要的课题。4 谷胱甘肽的测定方法目前测定谷胱甘肽含量的方法有多种,其中常用的有改良Tietze还原酶法、Griffith法、量热法、色谱法、分光光度法、毛细管电泳法、荧光光度法11等,下面介绍比较常用的几种方法。4.1 分光光度法郭黎平等12在测定大豆提取液中谷胱甘肽的含量时,发现在铜(II)2新铜试剂2谷胱甘肽2乙醇体系中测定谷胱甘肽的含量,乙醇具有明显的增敏作用。采用CuSO4溶液和新铜试剂混合液Cu2+2新铜试剂(12.5,摩尔比)作为显色剂,检测波长为456 nm,检测限为2.0g/ml,线性范围为2.024g/ml,回收率为99.54%,RSD为0.76%。赵旭东等13根据甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应速度的不同,提出了在含有其它巯基物质溶液中测定谷胱甘肽含量的方法,通过控制两个相同供试品和甲醛的不同反应时间,测定两者在波长为412 nm时的吸收度,根据两者不同的吸收度值得出谷胱甘肽的含量。线性范围为0.190.95 g/L,回收率为96.7%,方法的结果误差小于0.5%。该方法实验成本低,分析快速、简单,适于测定生物合成反应液中谷胱甘肽的含量。4.2 荧光法曹新志等14采用邻苯二甲醛(o2phthaldialdehyde,OPT)作为络合剂,在磷酸缓冲液(pH 8.0)中,应用荧光分光光度计来测定黄瓜中谷胱甘肽的含量。检测限为0.1g/ml,线性范围为0.140g/ml,回收率为99.73%,RSD为1.24%。Hissin等15选用OPT作为荧光剂,采用偏磷酸2磷酸钠2EDTA缓冲溶液(pH 8.0),用以测定哺乳动物心脏和肝脏中谷胱甘肽的含量,谷胱甘肽的检测限为0.05mol,线性范围为0.050.8mol,RSD为4%。4.3 高效液相色谱(HPLC)法Asensi等16采用甲醇2水为流动相,采用紫外/可见检测器检测大豆中谷胱甘肽的含量,检测限为1 nmol/L,RSD为1.5%。程敬君等17采用KCl溶液2HCl溶液2甲醇2EDTA为流动相,电化学检测器(工作电极为玻碳电极,参比电极为Ag/AgCl,工作电压为0.9 V),测定鼠脑微透析液中谷胱甘肽的含量,检测限为10 nmol/L,回收率为87.3%,RSD为1.8%。Brent等18用甲醇和乙酸钠溶液(pH 7)作为流动相,对苯二醛(Orthophthalaldehyde,OPA)和谷胱甘肽络合生成一种高荧光的三元环衍生物,荧光检测器,检测限为0.1 pmol,线性范围0.1200 pmol,谷胱甘肽的回收率为99.2%,RSD为1.2%。该方法线性范围较宽,而且稳定性较高,适于测定混合组分中谷胱甘肽含量。4.4 高效毛细管电泳法(HPCE)HPCE有非常好的分离效果。Frassanito等19采用HPCE测定生物供试品中谷胱甘肽的含量,紫外/可见检测器检测限为0.2g/ml,线性范围为0.2100g/ml,RSD为1%。1987年,有人对HPCE中的电化学检测技术作了改进,克服了紫外2可见吸收检测器所遇到的光程太短的问题。1993年Thomas等20在测定鼠脑组织中谷胱甘肽的含量时,在HPCE系统中采用了Hg修饰Au电极,以pH 5.5,10 mmol/L的22(N2吗啉)2乙基磺酸作为缓冲液,在0.15 V(vs Ag/AgCl)的电势下,检出限为0.53 fmol,RSD为2.1%。近年来,随着我国人们生活水平的提高,人们对功能性食品,尤其是抗病延寿抗衰老方面的重视程度也在逐渐增35中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2002年第23卷第1期 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/加,但具体到人们日常膳食中还有不小的差距。而日本在功能性食品应用方面已把我们远远地抛在了后边。因此,今后我们对谷胱甘肽的研究重点应放在以下三个方面:(1)进一步深化谷胱甘肽生物学功能的研究,加强临床应用方面的研究;(2)寻找更简便的测定方法,以便使其更适合于科研及日常监督的应用;(3)利用谷胱甘肽最大限度改善人们的日常膳食结构。参考文献1Vina J.G lutathione:Metabolism and Physiological FunctionsM.CRC Press,Boca Raton,FL,1990.2 郑云郎.谷胱甘肽的生物学功能J.生物学通报,1995,30(5):22224.3 金一尊,丁立,严敏芬.细胞谷胱甘肽含量与放射增敏研究J.辐射研究与辐射工艺学学报,1996,14(3):1722176.4 沈亚领,李爽,迟莉丽,等.谷胱甘肽的应用与生产J.工业微生物,2000,30(2):41245.5 王海鸥.面包酵母中谷胱甘肽对面团流变性质的影响J.无锡轻工业大学学报,1999,18(3):29232.6 袁而东,郑建仙.功能性食品基料2谷胱甘肽的研究进展J.食品与发酵工业,1999,25(5):52257.7 中国专利.91111019.8Fraternale A,T onelli A,Casabianca A,et al.Role of macrophage pro2tection in the development of murine AIDS J.AIDS,1999,21(2):81287.9K leinman WA,John P,Richie JR.Determination of thiols and disfidesusing highperformance liquid chromatography with electrochemicaldetection J.Chromatography B,1995,672:73280.10刘振玉.谷胱甘肽的研究与应用J.生命的化学,1995,15(1):19221.11 Floreani M,Petrone M,Debetto P,et al.A comparison between differ2ent method for the determination 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Chro2matography A,1998,795:53260.20 Thomas J,Shea O,Lunte SM.Selective detection of free thiols by cap2illary electrophoresis2electrochemistry using a gold/mercury amalgammicroelectrode J.Anal Chem,1993,65(3):2472250.直面WTO 中国生物制药的国际化征途于宏林,焦玉峰,李显林(徐州万邦制药有限公司,江苏 徐州 221002)中图分类号:R21 文献标识码:C 文章编号:100521678(2002)0120054203 生物医药在全球范围内蓬勃兴起,国内制药企业也纷纷进军生物制药行业,部分省份甚至将生物制药作为支柱产业。加入WTO后,中国生物制药业将面临怎样的挑战?中国“稚嫩弱小”的生物制药业如何获得生存空间?这是摆在我们每一个生物制药企业面前的紧迫课题。1 国内外行业发展状况目前,美国有1300多家生物技术公司,占全世界总数的收稿日期:2001211205;作者简介:于宏林(19652),男,江苏海安人,工程师,工商管理硕士,市场部主任,从事企业战略及药品市场营销策划工作。三分之二,生物技术市场资本总额超过400亿美元。年研究经费50亿美元以上,正式投入市场的生物工程药物40多个,已成功地创造出35个重要治疗药物。欧洲在发展生物药品方面进展较快。英、法、德、俄罗斯等国在开发、研制和生产生物药物方面成绩裴然,在某些生物技术领域甚至超过美国。日本在生命科学领域亦有一定建树,目前已有65%的生物技术公司从事生物医学研究,日本麒麟公司在此方面处在世界前列。新加坡最近宣布划出一块科技园区并投入巨资建设,用于吸引世界最大的生物医药公司落户。另外,韩国、中国台湾在该方面亦雄心勃勃。国外生物医药的发展方向,主要表现在以下几方面:(1)45中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2002年第23卷第1期 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/