XHPLC分析方法的验证专项方案.doc

XXX产品HPLC分析方法

确定方案

XXX制药

确定方案审批表
确定方案名称: XXX产品HPLC分析方法确定方案
确定方案编号：KY-ZL-YZ-FF-00400
审批
程序
部门
署名
日期
起草
检验室

审核
检验室主任

质量确保部

同意人
质量责任人

目 录
1 概述
2 确定目标
3 确定范围
4 确定小组组员和职责
5 确定方案审核和同意
6 进度计划
7 确定内容
8 变更和偏差
9 确定结果和评价汇报
10 确定合格证书

1 概述
我企业产品XXX产品采自《中国药典》二部，含量及相关物质、A、B、C检验均使用高效液相色谱仪进行检验，两个检验项目检验参数等条件完全相同，且我企业未对《中国药典》二部中方法进行过任何改变，所以根据新版GMP要求，需要进行分析方法确定。本确定方案使用LC-AH型高效液相色谱仪对XXX产品采取《中国药典》二部“含量”、“相关物质”及“A、B、C”检验方法进行确定，证实此方法在本企业试验室适用性。依据《药品GMP指南（质量控制试验室和物料系统）》分册要求，“含量”、“相关物质”及“A、B、C”项需确定项目以下：
确定项目
正确度
精密度
专属性
定量限
含量
是
是
是
否
相关物质
否
是
是
是
A、B、C
否
是
是
是
“是”代表该项内容需确定，“否”代表该项内容不需要确定
2 确定目标
经过对XXX产品含量及相关物质A、B、C检验方法确实定，证实此方法在本企业试验室适用性。
3 确定范围
本确定方案适适用于XXX产品含量及相关物质A、B、C、检验方法进行确定。
4 确定小组组员和职责

部门及职务
确定工作中职责
检验员
确定实施人：负责起草确定方案，实施确定方案，负责验
证过程中相关检验操作，搜集整理数据，起草确定汇报。
质量确保部
负责确定方案、确定汇报审核；审核确定过程中发生偏差处理方案，和采取纠正行动。
检验室主任
确定小组组长：组织确定实施，负责确定方案审核、组织起草确定汇报并审核。
质量责任人
确定总责任人：负责确定方案、汇报同意
5 确定方案起草和审批
5.1 确定方案起草和审批：确定方案由检验室起草，确定小组会审，质量责任人同意实施。
5.2 确定方案培训：确定方案经同意后，实施前由确定方案起草部门组织确定方案参与者进行培训。
5.3 确定方案修改：确定方案如需修改，由质量责任人同意实施，在确定汇报中表现。
6 进度计划
整个确定活动实施时间：
确定时间：从_____年___月__日 至_____年__ 月__ 日；
起草汇报：从_____年___月__日 至_____年__ 月__ 日；
7 确定内容
7.1确定前仪器及材料检验
7.1.1确定前，对下列试验用仪器和材料进行检验
7.1.1.1岛津 高效液相色谱仪
7.1.1.2 TG-332A型分析天平
7.1.1.3色谱柱：C18（4.6*250㎜）
7.1.1.4对照品和试剂：产品X二醇物对照品、对硝基苯甲醛对照品、产品X对照品、羟苯甲酯对照品、羟苯乙酯对照品、羟苯乙酯对照品、庚烷磺酸钠，乙腈（色谱级），甲醇（色谱级），磷酸二氢钾、三乙胺、磷酸、蒸馏水
7.1.1.5其它部分辅助玻璃仪器（如量瓶、移液管等）
7.1.2可接收标准：仪器和用具经校验且在效期内；对照品、试液、试剂和试药符合验证要求且在效期内；色谱柱使用状态正常。
7.1.3结果统计：将结果统计在附件1《确定前仪器及材料检验表》 中。
7.2确定包含文件检验
7.2.1确定前，对和此次确定相关文件进行检验
7.2.1.1XXX产品成品检验操作规程（KY-ZL-SOP-CP-00400）
7.2.1.2 型高效液相色谱系统标准操作及维护保养规程（KY-SB-SOP-JY-03700）
7.2.1.3 型高效液相色谱系统维护保养及清洁操作规程（KY-WS-SOP-JY-03700）
7.2.1.4TG-332A型分析天平标准操作规程（KY-SB-SOP-JY-02300）
7.2.1.5TG-332A型分析天平维护保养及清洁标准操作规程（KY-WS-SOP-JY-02300
7.2.1.6高效液相色谱法标准操作规程 （KY-ZL-SOP-ZK-03300）
7.2.1.7XXX产品HPLC分析方法验证方案（KY-YZ-SOP-JY-00400）
7.2.1.8XXX产品生产工艺规程（KY-SC-JB-GY-00400）
7.2.1.9检验方法验证（确定）管理程序（KY-ZL-SMP-05800）
7.2.2可接收标准：全部文件全部应为现行版本，且经过同意。
7.2.3结果统计：将结果统计在附件2《确定前文件检验表》中。
7.3人员培训确定
7.3.1检验并确定全部参与实施确定人员是否已得到培训，并在培训统计上签字。
7.3.2可接收标准：验证小组组员均已经过培训，并在培训统计上签字。
7.3.3确定结果：将确定结果填入附件3《人员培训、参与情况确定统计》中。
7.4 确定项目
7.4.1 “含量”项确定
7.4.1.1反复性/正确度
7.4.1.1.1空白基质制备：精密称定硼酸：13.125g硼砂：0.6g玻璃酸钠：1g羟苯乙酯：0.5g根据XXX产品生产工艺规程（KY-SC-JB-GY-00400）配制加注射用水至1000ml。
7.4.1.1.2对照液制备：称取产品X对照品用注射用水配制成1ml含2.5mg溶液，取本品用流动相定量稀释制成每1ml中含0.1mg溶液摇匀，作为对照液备用。对照液平行制备2份，标识为S-1、S-2（浓度为标示量100%）。
7.4.1.1.3样品制备：称取产品X对照品用空白基质水溶解后定容，摇匀，备用。平行制备浓度梯度为标示量80%、100%、120%样品各3份，标识为A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7、A-8、A-9。
7.4.1.1.4照《高效液相色谱仪标准操作规程》测定。
色谱条件和系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为0.01mol/L庚烷磺酸钠缓冲溶液（取磷酸二氢钾6.8g，用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液溶解并稀释至1000ml，再加三乙胺5ml，混匀，用磷酸调整PH值至2.5），流动相B为甲醇；检测波长为277nm；按下表进行线性梯度洗脱。另取产品X对照品、产品X二醇物对照品、对硝基苯甲醛对照品、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯对照品各适量，加甲醇适量（产品X每10mg加甲醇1ml）使溶解，用流动相定量稀释成每1ml中含产品X0.5mg、产品X二醇物40ug和对硝基苯甲醛3ug、羟苯甲酯40ug、羟苯乙酯50ug和羟苯丙酯20ug混合溶液。精密吸收该溶液10µl注入色谱仪，作为系统适用性溶液。统计色谱图。各相邻峰间分离度均应符合要求）（应大于1.5）。
时间（分钟）
流动相A(%)
流动相B(%)
0
15
40
50
60
68
68
35
68
68
32
32
65
32
32
7.4.1.1.5测定：精密量取上述A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7、A-8、A-9溶液用流动相定量稀释制成每1ml中含0.1mg溶液，摇匀，精密量取10ul，注入液相色谱仪，统计色谱图。
1）取S-1精密量取10ul，注入液相色谱仪统计色谱图，该溶液连续进样2针。
2）取S-2精密量取10ul，注入液相色谱仪，统计色谱图，该溶液连续进样1针。
3）分别精密量取稀释后A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7、A-8、A-9溶液各10ul，注入液相色谱仪，统计色谱图。
4）计算S-1和S-2F值，相对标准偏差应≤2.0%，以外标法计算稀释后A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7、A-8、A-9溶液含量。
结果计算
含量（cx）=CR×Ax/AR
cx-------- 为供试品浓度；
CR---------为对照品浓度；
Ax-------- 为供试品峰面积；
AR---------为对照品峰面积。
7.4.1.1.6可接收标准：稀释后A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7、A-8、A-9各浓度含量均应在标示量±3%，且各浓度样品含量RSD%值应≤2.0%。
7.4.1.1.7确定统计和数据
确定数据和结果统计于附件4《含量精密度/正确度确定数据和结果》中。
7.4.1.2专属性
7.4.1.2.1 测试方法：
7.4.1.2.1.1取空白基质进样1针，统计色谱图。
7.4.1.2.1.2 精密量取样品（用成品即可）用流动相A-B（68：32）定量稀释制成每1ml中含产品X0. 1mg溶液，作为供试品溶液，精密量取10ul，注入液相色谱仪，进样1针，统计色谱图，取得产品X保留时间。
7.4.1.2.1.3取产品X对照品用流动相定量稀释制成每1ml中含产品X0. 1mg溶液，作为对照品溶液，注入液相色谱仪，进样1针，统计色谱图，取得产品X保留时间。
7.4.1.2.1.4可接收标准：溶剂空白对应峰对样品测定有没有显著干扰；供试品图谱中产品X主峰保留时间和对照品图谱中产品X主峰保留时间一致。
7.4.1.2.1.5 确定统计和数据
确定数据和结果统计于附件5《专属性确定数据和结果》中。
7.4.2“相关物质”及“A、B、C”项确定
7.4.2.1专属性
7.4.2.1.1精密量取样品（用成品即可）用流动相A-B（68：32）定量稀释制成每1ml中含产品X0.5mg溶液，作为供试品溶液。
7.4.2.1.2对照溶液；取产品X对照品、产品X二醇物对照品、对硝基苯甲醛对照品、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯对照品各适量，加甲醇适量（产品X每10mg加甲醇1ml）使溶解，用流动相定量稀释成每1ml中含产品X0.5mg、产品X二醇物40ug和对硝基苯甲醛3ug、羟苯甲酯40ug、羟苯乙酯50ug和羟苯丙酯20ug混合溶液。作为对照溶液；照含量项下色谱条件，取对照品溶液10ul，注入液相色谱仪，调整检测灵敏度，使产品X二醇物峰高约为满量程64%。
7.4.2.1.3精密量取供试品溶液和对照品溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，进样1针，统计色谱图。
7.4.2.1.4可接收标准：供试品图谱中产品X、产品X二醇物、对硝基苯甲醛、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯各峰保留时间和系统适用性图谱中相对峰保留时间一致。溶剂空白对应位置无峰干扰。
7.4.2.1.5确定统计和数据
确定数据和结果统计于附件5《专属性确定数据和结果》中。
7.4.2.2精密度
7.4.2.2.1测试程序
7.4.2.2.1.1取含量项下系统适用性溶液作为对照溶液D-1；另按同法制备一份对照品作为对照溶液D-2。
7.4.2.2.1.2取样品用含量测定项下流动相A-B（68：32）定量稀释制成每1ml中含产品X0.5mg溶液，配制6分平行样品作为供试品溶液分别为B-1～B-6。
7.4.2.2.1.3 D-1进样2针，D-2进样1针，然后B-1～B-6分别进针，统计色谱图。
7.4.2.2.1.4各相邻峰之间分离度应≥1.5
7.4.2.2.1.5计算D-1和D-2F值，相对标准偏差应≤2.0%，以外标法计算B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6溶液中各相关物质含量。
计算：产品X二醇物（%）=S二醇物×C二醇物对照/ S二醇物对照×C供试品×100%
对硝基苯甲醛（%）=S对硝基苯甲醛×C对硝基苯甲醛对照/ S对硝基苯甲醛对照×C供试品×100%
羟苯甲酯（%）=S羟苯甲酯×C羟苯甲酯醛对照/ S羟苯甲酯对照×C供试品×100%
羟苯乙酯（%）=S羟苯乙酯×C羟苯乙酯对照/ S羟苯乙酯对照×C供试品×100%
羟苯丙酯（%）=S羟苯丙酯×C羟苯丙酯对照/ S羟苯丙酯对照×C供试品×100%
7.4.2.2.1.2可接收标准：6个样品B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6含量RSD%值应≤2.0%。
7.4.2.2.1.3确定统计和数据
确定数据和结果统计于附件6《相关物质及A、B、C精密度确定数据和结果》中。
7.4.2.3定量限
7.4.2.3.1在上述色谱条件下取产品X二醇物对照品用流动相稀释成每1ml中含产品X二醇物40ug溶液，进样，再逐步稀释置合适浓度，进样，直至当待测组分信噪比约为10倍时（即产品X二醇物峰高为噪音峰高约10倍时），对应浓度为该组分最小定量浓度(Cm2)，反复进样3次，统计色谱图。
7.4.2.3.2在上述色谱条件下取对硝基苯甲醛对照品用流动相稀释成每1ml中含对硝基苯甲醛3ug溶液,进样，再逐步稀释置合适浓度，进样，直至当待测组分信噪比约为10倍时（即对硝基苯甲醛峰高为噪音峰高约10倍），对应浓度为该组分最小定量浓度(Cm2)，反复进样3次，统计色谱图。
7.4.2.3.3因本企业产品中加入是羟苯乙酯，故只做羟苯乙酯定量限，上述色谱条件下取对硝基苯甲醛对照品用流动相稀释成每1ml中羟苯乙酯50ug溶液,进样，再逐步稀释置合适浓度，进样，直至当待测组分信噪比约为10倍时（即对硝基苯甲醛峰高为噪音峰高约10倍），对应浓度为该组分最小定量浓度(Cm2)，反复进样3次，统计色谱图。
7.4.2.3.2计算公式

式中：hi：测试溶液中产品X二醇物、对硝基苯甲醛峰高；
hb：基线噪声峰高；
h0：空白溶液色谱图中基线峰高。
7.4.2.3.3可接收标准：上述杂质定量限应小于产品中各类杂质程度标准10%。
7.4.2.3.4确定统计和数据
确定数据和结果统计于附件7《定量限确定数据和结果》中。
8 变更和偏差
若确定方案需要变更，须按方案制订时审批程序进行同意；若系统发生重大变更，应重新制订确定方案。
确定过程中应严格根据本确定方案实施，出现部分项目不符合标准结果时，应按偏差管理规程进行处理，有异常事项未处理时，不得进行下一步工作。
全部偏差、异常情况处理过程均应统计立案，并登记到附件8中。
9 确定结果和评价汇报
由质量确保部和检验室主任对分析方法确定结果进行审核，检验全部测试项目已经完成；变更和偏差全部已经得四处理和同意；每个项目均应符合它们确实定可接收标准；确定统计完整。由检验室填写确定汇报，由确定小组长在汇报中签署评审结论，提交确定总责任人进行同意。附件9中。
10 确定合格证书
确定结果和评价汇报经同意人同意签字后，质量受权人签发验证合格证书。附件10。

附件目录
附件
附件名称
附件1
确定前仪器及材料检验表
附件2
确定前文件检验表
附件3
人员培训、参与情况确定统计
附件4
含量精密度/正确度确定数据和结果
附件5
专属性验证数据和结果
附件6
相关物质及A、B、C精密度确定数据和结果
附件7
定量限确定数据和结果
附件8
变更偏差情况确定统计
附件9
确定结果和评价汇报
附件10
确定合格证书

附件1
确定前仪器及材料检验表
序号
名 称
仪器编号
试液、试药批号
证书编号
使用期至

确定标准
确定结果
确定所用仪器经过校验且在使用期内，试药、试液均在使用期内，标准滴定液经过标定且在使用期内。

确定结论：

检验人/日期

复核人/日期

附件2
确定前文件检验表
文件名称
文件编号
是否现行文本
检验方法验证（确定）管理程序
KY-ZL-SMP-05800

TG -332A型分析天平标准操作规程
KY-SB-SOP-JY-02300

TG-332A型分析天平维护保养及清洁标准操作规程
KY-WS-SOP-JY-02300

LC-AHT型高效液相色谱系统标准操作规程
KY-SB-SOP-JY-03700

LC-AHT型高效液相色谱系统维护保养及清洁标准操作规程
KY-SB-SOP-JY-03700

高效液相色谱法标准操作规程
KY-ZL-SOP-ZK-03300

XXX产品成品检验操作规程
KY-ZL-SOP-CP-00400

XXX产品生产工艺规程
KY-SC-JB-GY-00400

XXX产品HPLC分析方法确实定方案
KY-YZ-SOP-JY-00400

检验人

检验日期

检验结果

附件3
人员培训、参与情况确定统计
讲课地点

日 期

讲课内容

部门
职务
培训人
检验室
检验室主任

部门
职务
受培训并参与方案实施人员
检验室
检验员

检验室
检验员

质量确保部
质监四处长

质量确保部
质量授权人

确定标准
确定结果
确定全部参与实施本确定人员已经得到培训，并在培训统计中签字。

确定结论：

检验人/日期

复核人/日期

附件4
含量精密度/正确度确定数据和结果
1 S-1
No
1
2
3
平均值
RSD
产品X峰面积

2 S-2
No
1
2
平均值
RSD
产品X峰面积

3 80%浓度
No
A-1
A-2
A-3
平均值
RSD
含量
产品X峰面积

4 100%浓度
No
A-4
A-5
A-6
平均值
RSD
含量
产品X峰面积

5 120%浓度
No
A-7
A-8
A-9
平均值
RSD
含量
产品X峰面积

6 确定结论
可接收标准
验证结果
是否符合
各浓度含量RSD%值应≤2.0%

各浓度含量均应在标示量±3%

确定结论：
检验人/日期

复核人/日期

附件5
专属性验证数据和结果
确定项目
对照品
保留时间
样品
保留时间
检验结果
检验人
检验日期
含量专属性
产品X

相关物质
专属性
产品X二醇物

对硝基苯甲醛

羟苯甲酯

羟苯乙酯

羟苯丙酯

检验人/日期

复核人/日期

备注
附检验原始统计
确定结论：
检验人/日期

复核人/日期

附件6
相关物质及A、B、C精密度确定数据和结果
1 D-1
No
1
2
3
RSD
平均值
产品X二醇物峰面积

对硝基苯甲醛峰面积

羟苯甲酯峰面积

羟苯乙酯峰面积

羟苯丙酯峰面积

2 D-2
No
1
2
RSD
平均值
产品X二醇物峰面积

对硝基苯甲醛峰面积

羟苯甲酯峰面积

羟苯乙酯峰面积

羟苯丙酯峰面积

3 样品
No
产品X二醇物
峰面积
对硝基苯甲醛峰面积
羟苯甲酯峰面积
羟苯乙酯峰面积
羟苯丙酯峰面积
B-1

B-2

B-3

B-4

B-5

B-6

RSD

平均值

含量

4确定结论
可接收标准
验证结果
是否符合
各相关物质含量RSD%值应≤2.0%

确定结论：

检验人/日期

复核人/日期

附件7
定量限验证数据和结果
1.定量限测定结果
项目
名称
信噪比
最小定量浓度
（µg/mL）
产品X二醇物

对硝基苯甲醛

羟苯乙酯

检验人/日期

复核人/日期

2确定结论
确定结论：
检验人/日期

复核人/日期

附件8
变更偏差情况统计

序号
发生日期
偏差/变更内容描述
处理方法
署名/日期

确定标准
确定结果
在本方案实施过程中所发生偏差或变更，已处理完成并已作好统计。

确定结论：

检验人/日期

复核人/日期

附件9
确定结果和评价汇报
分析方法名称

验证参与人员

验证时间
年 月 日至 年 月 日
检测项目
验证情况
是否经过
1
精密度

3
专属性

4
定量限

质量确保部确定结论:

署名/日期：
验证小组长评审结论：

署名/日期：
验证总责任人同意意见：

署名/日期：

附件10

XXX制药
确 认 合 格 证 书

项目名称：

XXX产品HPLC分析方法

依据中国GMP要求，依据我企业《验证管理文件》，经对该项目进行验证，结果符合要求。
特发此证

签发人：
年 月 日