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细胞学实验报告 六 Hela 细胞凋亡诱导及检测 生 96 华以超 2009030049 1/4 细胞学实验报告细胞学实验报告 六六 Hela 细胞凋亡诱导及检测细胞凋亡诱导及检测 生 96 华以超 2009030049 同组姓名：赵宇 实验日期：2010.11.12-13 一、一、实验原理：实验原理：细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。通过细胞凋亡，机体得以消除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。细胞凋亡有确保正常生长、发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能的作用。凋亡过程中的细胞在形态学和很多生化指标上与正常细胞和坏死的细胞都有明显区别（表 1）：表表 1.细胞凋亡和细胞坏死的区别细胞凋亡和细胞坏死的区别 区别点区别点 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死 起因 生理或病理性 病理性变化或剧烈损伤 范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞 细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损 染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状 细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解 细胞体积 固缩变小 肿胀变大 凋亡小体 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬 基因组DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状 随机降解，电泳图谱呈涂抹状 蛋白质合成 有 无 调节过程 受基因调控 被动进行 炎症反应 无，不释放细胞内容物 有，释放内容物。Hoechst33258 为特异性 DNA 染料，与 A-T 键结合，但在 pH2.0 环境下则优先与 RNA结合，染色 DNA 时应调整染液的 pH 至 7.0，这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在 4中避光保存。细胞学实验报告 六 Hela 细胞凋亡诱导及检测 生 96 华以超 2009030049 2/4 二、二、实验步骤：实验步骤：1 细胞凋亡的诱导细胞凋亡的诱导 Hela 细胞传代培养 16h 后，镜下观察细胞状态：细胞边缘为多边形并聚集形成细胞岛，可推断细胞此时为贴壁生长；向培养皿内加入200L H2O2溶液（母液浓度为8.8mmol/L，终浓度为0.8mmol/L），轻轻晃动将其混合均匀（滴加溶液时要轻，不要冲击细胞层）；放回 37、5CO2条件温箱继续培养。2 DAPI 染色染色 镜检观察细胞形态与贴壁情况；收集细胞：吸去培养基，用 PBS 用洗涤后，加入 200l 胰酶 37消化至细胞多数变圆（约 2min 左右）；加入 1mL PBS，吹吸至细胞由底部脱落；将细胞培养液转至 1.5mL EP 管中，1000rpm 离心 5min；吸出上清，于沉淀中加入 100l 甲醇，重悬细胞后，室温固定 10min；1000rpm 离心 5min 弃上清，加 100l PBS 洗涤沉淀细胞；1000rpm 离心 5min 后弃上清，加入适量 DAPI 染液于 37避光避光染色 10min；1000rpm 离心 5min 后弃上清，加入 100l PBS 洗涤；1000rpm 离心5min 后弃上清，加入适量PBS 重悬细胞，使细胞密度适宜观测；取 15l 细胞悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察，选取典型凋亡阶段的细胞拍照。三、三、实验结果：实验结果：1 未经未经 H2O2诱导的细胞对照（图诱导的细胞对照（图 1，感谢韩笑同学），感谢韩笑同学）图图 1 未经未经 H2O2诱导的诱导的 Hela 细胞（细胞（10*？）？），即未凋亡的正常细胞，即未凋亡的正常细胞 细胞学实验报告 六 Hela 细胞凋亡诱导及检测 生 96 华以超 2009030049 3/4 2 经经 H2O2诱导过的诱导过的 Hela 细胞（图细胞（图 2）图图 2 经经 H2O2诱导过的诱导过的 Hela 细胞（细胞（10*40）图图 2a 开始固缩的细胞，体积较周围细胞小，染色明显开始固缩的细胞，体积较周围细胞小，染色明显 图图 2b 边缘开始出现芽体边缘开始出现芽体 图图 2c 边集状态，并有形成凋亡小体的趋势边集状态，并有形成凋亡小体的趋势 四、四、实验实验分析与小结：分析与小结：同 HE 染色，细胞凋亡实验做得仍然是艰辛曲折，可能是同时在一起做有些手忙脚乱的缘故吧。其实不管是 HE 染色还是细胞凋亡的观察我拿到的细胞都是很多的，可惜我没有好好利用起来，或者说我把这么好的实验条件给糟蹋了。细胞学实验报告 六 Hela 细胞凋亡诱导及检测 生 96 华以超 2009030049 4/4 有两个地方，一个是甲醇重悬细胞的时候，我加完甲醇上了闹铃就干别的事情去了，时间到了就去离心，离心完了才发现：EP 管底部根本就没有细胞因为细胞全部附着在管壁，厚厚一层！无奈之下只好小心翼翼地把细胞吹下去，重新泡10min，再离心这样一来又耽误了 15min，而且效果还不是很好。第二是加入DAPI 后，我没有注意到需要避光染色！以至于 10min 后发现这一点只好又重新染了几分钟。当时没意识到这个问题的严重性，于是待制片时，虽然有黏黏糊糊一大坨细胞，但颜色却几乎没染上好在制片时没有取完所有的细胞，结果只好重新进行染色虽然结果算是弥补了，但是照相却还要重新排队，当时真是有种欲哭无泪的感觉！由于时间比较匆忙，于是当时并没有细细挑选好看的细胞，只是随便拍了一张就离开了。但之后看来效果还算说得过去吧。同时也惊叹于生物技术的神奇，原本只能在教科书上看到一些关于细胞凋亡的描述，没想到在这节课里只用一些简单的操作，配合荧光显微镜，竟然真的看到了细胞凋亡时各种神奇的形态！如果有机会的话，我希望能再多加练习一下这两种染色。最后，感谢老师和助教在课上给予我耐心的帮助和指点！五、五、参考文献：参考文献：1 王宏英等，细胞生物学实验指导，清华大学生物科学与技术系，王宏英等，细胞生物学实验指导，清华大学生物科学与技术系，2009 年年 9月月 2010/11/19