单核巨噬细胞(RAW-264.7)复苏与培养、消化与冻存.doc

单核巨噬细胞（RAW 264.7）复苏与培养、消化与冻存

1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 细胞及中药单体成分：小鼠RAW 264.7单核巨噬细胞株购自上海细胞库；LPS购于sigma公司；
1.1.2 主要试剂
RPMI-1640培养液：Gbico公司产品
胎牛血清：Gbico公司产品
DMSO(批号DZ0231)：AMRESCO公司产品
胰蛋白酶：Merck公司产品
青霉素-链霉素：Gbico公司
MTT、台盼蓝试剂：Sigma公司产品
PBS：上海双螺旋生物科技有限公司
TNF-α ELISA试剂盒：美国eBioscience公司
1.1.3 仪器
CO2培养箱：美国Thermo Froma公司
酶标仪：Biorad公司
倒置显微镜：日本olympus公司
高速低温冷冻离心机：德国Eppendorf公司
侧摆摇床：欧瑞实验器材公司
培养瓶/培养皿、24孔/48孔/96孔培养板、离心管：美国BD公司

1.2实验方法
1.2.1单核巨噬细胞（RAW 264.7）复苏与培养：实验操作前，先将水浴锅预先调至37℃，无血清的RPMI- 1640培养液于37 ℃水浴锅内预热，15 ml的离心管4 ℃热平衡；用镊子将单核巨噬细胞（RAW 264.7）的细胞冻存管从液氮罐中取出，浸入含37 ℃水的烧杯内，轻轻晃动冻存管，冻存管内冰核差不多融化时取出冻存管移至超净工作台内，用酒精棉球擦拭管口；在15 ml离心管内加入4 ml含10 % FBS及1 % 青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液，再将冻存管内含细胞的悬液吸至该离心管内，盖上管盖，轻轻摇匀和上下颠倒混匀；继续添加含10 % 胎牛血清、1 % 青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液至离心管刻度14 ml处，盖上管盖，轻轻颠倒混匀；离心机设置4 ℃，1000 rpm，离心5 min后，小心吸出上清液，然后轻弹离心管底部使细胞团分散，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液14 ml，盖上管盖，轻轻颠倒混匀，4 ℃，1000 rpm离心5 min，弃上清液，加2 ml无血清的RPMI- 1640培养液混匀，取50 μl细胞悬液使用台盼蓝试剂进行活细胞计数；加细胞培养液稀释至所需的细胞浓度，移至培养瓶内培养内置于含5 % CO2培养箱（37 ℃）中，1-2 d 更换细胞培养液1次，呈贴壁生长，2-3 d用0.25 % 胰酶消化传代1次。

1.2.2单核巨噬细胞（RAW 264.7）消化与冻存
l 单核巨噬细胞（RAW 264.7）消化: 实验操作前，先将水浴箱预先调至37 ℃，将0.25 % 胰酶及含10 % 胎牛血清、1 % 青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液置于37 ℃水浴箱中水浴备用，将长满单核巨噬细胞（RAW 264.7）的培养瓶中原培养液弃去，用PBS洗涤3次，再加入1-2 ml 0.25 % 胰酶，使瓶底细胞都浸入胰酶溶液中，于含5% CO2的37 ℃培养箱中消化3 min；在倒置显微镜下观察细胞，原贴壁细胞逐渐趋于圆形时，加入10 ml含10 % 胎牛血清、1 % 青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液终止消化；轻轻敲打培养瓶并用吸管将贴壁细胞吹打成悬液，分别转移至15 ml离心管中，盖上管盖，轻轻颠倒混匀，4 ℃，1000 rpm离心5 min，弃上清液，加4 ml含10 % 胎牛血清、1 % 青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液混匀，取50μl细胞悬液进行细胞计数，再加适应量的含10 % FBS及1 % 青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液稀释至细胞密度为1x106个/ml；再移至培养瓶或24孔板内培养内置于培养箱（5 % CO2，37℃）中培养。

l 单核巨噬细胞（RAW 264.7）冻存：将备好的细胞冻存管做好标记（RAW 264.7、日期、实验室单位），配置好一定量的细胞冻存液，配置比例为RPMI- 1640培养液：血清：DMSO = 7：2：1；将已经消化下来的细胞悬液4 ℃，1000 rpm离心5 min，弃上清液，留下细胞，缓慢加入已经配好的细胞冻存液，轻轻混匀；每个细胞冻存管中加入含冻存液的细胞悬液1.8 ml，盖上瓶盖，置于梯度降温盒内，再分别放在4 ℃冰箱内30 min、-20 ℃ 冰箱内2 h和-80 ℃ 冰箱内过夜；第二天放于液氮罐内并且做好标记和登记工作（存放单位、存放时间、存放管数）。