总大肠菌群检验法.docx

2.总大肠菌群
2.1多管发酵法
范围
本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。
本标准适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。
术语和定义
以下术语和定义适用于本标准。
总大肠菌群系指一群在37P培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。
水中总大肠菌群数系以1mL水样中总大肠菌群最可能数(MPN)表示。
培养基与试剂
乳糖蛋白胨培养液
2.1.3.1. 成份
A蛋白胨10g
B牛肉膏3g
C乳糖5g
D氯化钠5g
E溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL
F蒸馏水10mL
2.1.3.1. 制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2〜7.4,再参加1mL 16g/L
的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95Kpa (115C 10 lb高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
按上述乳糖蛋白胨培养液(2.1.3.除蒸馏水外，其它成份量加倍。
伊红美蓝培养基
2.1.3.3. 成份
A蛋白胨10g
B 乳糖 10g
C磷酸氢二钾2g
D琼脂20〜30g
E蒸馏水10mL
F伊红水溶液(20g/L) 20mL
G美蓝水溶液(5g/L) 13mL
2.1.3.3. 制法
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2参加乳糖，混匀后分装，
以68.95Kpa (115C 10 lb高压灭菌20min。临用时加热融化琼脂，冷至50〜55C，参加
伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。
革兰氏染色液
2.1.3.4. 结晶紫染色液
A 成份
a结晶紫1g

b 乙醇〔(C2H5OH)=95%〕20mL
c草酸铵水溶液（10g/L） 80mL
B制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成份，易出现假阳性。结晶紫溶液放置过
久会产生沉淀，不能再用。
2.1.3.4. 革兰氏碘液
A 成份
a 碘 1g
b碘化钾2g
c蒸馏水3mL
B制法：将碘和碘化钾先进展混合，参加蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
2.1.3.4. 脱色剂：乙醇〔（C2H5OH）=95%〕。
2.1.3.4. 沙黄复染液
A成份
a沙黄0.25g
b 乙醇〔（C2H5OH）=95%〕10mL
c蒸馏水90mL
B制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后参加蒸馏水。
2.1.3.4 .染色法
A将培养18〜24h的培养物涂片。
B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
C滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗。
E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。
仪器
培养箱：36±TC。
冰箱：0〜4C。
天 平。
显微镜。
平皿：直径为 9cm。
试管。
2.1.4. 分度吸管：1mL，10mL。
锥形瓶。
小倒管。
2.1.4.1（载玻片。
检验步骤
乳糖发酵试验
2.1.5.1. 取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。
对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双
料培养基，每份接种10mL水样。
2.1.5.1. 检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1, 0.1, 0.011＜至
0.1, 0.01, 0.Lm每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。 接种1mL以下水样时，
必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。
2.1.5.1. 将接种管置36±TC培养箱内，培养24 ±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按以下步骤进展。
别离培养
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36±1 C培养箱内培养18〜
24h，观察菌落形态，挑取符合以下特征的菌落：
深紫黑色、具有金属光泽的菌落，
紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落，
淡紫红色、中心较深的菌落，
作革兰氏染色、镜检和证实试验。
证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36±1C培养箱中培养24 ±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
结果报告
根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每1mL水样中的总大肠菌群MPN值。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告未检
出总大肠菌群。
表2-1用5份10mL水样时，各种阳性和阴性结果组合时的MPN
5个10mL管中阳性管数MPN0 0
1 2.2
2 5.1
3 9.2
4 16.0
5 >16
表2-2大肠菌群(MPN)检索表
〔总接种量55.5mL，其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样〕接种量，mL接种量，mL
mL 0mL
10 1 0.1 10 1 0.1
12
121014
241026
351038

4710410
5910512
01021104
01141116
01261128
013711310
014911412
0 1 5 11 1 1 5 14
0 2 0 4 1 2 0 6
0 2 1 6 1 2 1 8
0 2 2 7 1 2 2 10
0 2 3 9 1 2 3 12
0 2 4 11 1 2 4 15
0 2 5 13 1 2 5 17
0 3 0 6 1 3 0 8
0 3 1 7 1 3 1 10
0 3 2 9 1 3 2 12
0 3 3 11 1 3 3 15
0 3 4 13 1 3 4 17
0 3 5 15 1 3 5 19
0 4 0 8 1 4 0 11
0 4 1 9 1 4 1 13
0421114215
0431314317
0441514419
0451714522
0 5 0 9 1 5 0 13
0511115115
0521315217
0531515319
0541715422
0551915524
2 0 0 5 3 0 0 8
2 0 1 7 3 0 1 11
2 0 2 9 3 0 2 13
2 0 3 12 3 0 3 16
2 0 4 14 3 0 4 20
2 0 5 16 3 0 5 23

2 1 0 7 3 1 0 11
2 1 1 9 3 1 1 14
2121231217
2131431320
2141731423
2151931527
2 2 0 9 3 2 0 14
2211232117
2221432220
2231732324
2241932427
2252232531
2301233017
2311433121
2321733224
2332033328
2342233432
2352533536
2401534021
2411734124
2422034228
2432334332
2442534436
2452834540
2501735025
2512035129
2522335232
2532635337
2542935441
2553235545
413523
4011750131
4022150243
4032550358
4043050476
4053650595

4101751033
4112151146
4122651263
4133151384
41436514110
41542515130
4202252049
4212652170
4223252294
42338523120
42444524150
42550525180
4302753079
43133531110
43239532140
43345533180
43452534210
43559535250
44034540130
44140541170
44247542220
44354543280
44462544350
44569545430
45041550240
45148551350
45256552540
45364553920
4547255416
45581555>16
2.2滤膜法
范围
本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。
本标准适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。
术语和定义
以下术语和定义适用于本标准。
总大肠菌群是指用孔径为0.45叩的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在选择性品红亚硫酸钠培养基上37T培养24h,能形成紫红或红色有金属光泽的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性
无芽胞杆菌。计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。
水中总大肠菌群数系以1mL水样中总大肠菌群菌落形成单位(CFU)表示。
培养基与试剂
品红亚硫酸钠培养基
2.2.3.1. 成 份
A蛋白胨10g
B酵母浸膏5g
C牛肉膏5g
D乳糖10g
E琼脂15〜20g
F磷酸氢二钾3.5g
G无水亚硫酸钠5g左右
H碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL
I蒸馏水10mL
2.2.3.1. 储藏培养基的制备
先将琼脂加到5mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另5mL蒸馏水中参加磷酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补足蒸馏水至10mL，混匀后调pH为7.2〜7.4,再参加乳糖，分装，68.95Kpa (115C 10 lb高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
2.2.3.1. 平皿培养基的配制
将上法制备的储藏培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储藏培养基内，并充分混匀防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿内。待冷却凝固后置冰箱内备用。
此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用。
乳糖蛋白胨培养液，同多管发酵法2.1.3.。1
仪器
.滤器。
滤膜，孔径0.45叩。
抽滤设备。
无齿镊子。
其他仪器同多管发酵法
检验步骤
准备工作
2.2.5.1. 滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，参加蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2〜3次，以除去残留溶剂。
2.2.5.1. 滤器灭菌：用点燃的酒精棉球火焰灭菌。也可用蒸汽灭菌器103.43Kpa (121C15 lb)高压灭菌20min。
过 滤水样
用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘局部，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤
器，将1mL水样如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。
培养
水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘局部，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37P恒温箱内培养22〜24h。
结果观察与报告
挑取符合以下特征菌落进展革兰氏染色、镜检。
紫红色、具有金属光泽的菌落，
深红色、不带或略带金属光泽的菌落，
淡红色、中心色较深的菌落。
2.2.6.1. 凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，于37P培养
24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。
2.2.6.1. 计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每1mL 水样中的总大肠菌群数报告之(CFU /1mL)。
数出的总大肠菌群菌落数X1
总大肠菌群菌落数〔CFU/1mL〕=(H——…
过滤的水样体积(mL)