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第 29 卷 第 13 期 农 业 工 程 学 报 Vol.29 No.13 2013 年 7 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jul.2013 277 单宁酶处理提高茶梗儿茶素含量及茶梗提取液生物活性 黄玉凤1，肖安风1,2,3,4，倪 辉1,2,3,4，蔡慧农1,2,3,4（1.集美大学生物工程学院，厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，厦门 361021；3.福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，厦门 361021；4.厦门市食品与生物工程技术研究中心，厦门 361021）摘 要：为综合利用茶叶加工副产物茶叶梗，试验设计利用固态发酵得到的单宁酶处理茶梗，比较不同处理条件下的茶梗提取液中儿茶素组成的差异及还原力、DPPH 和 OH 自由基清除率、胰-淀粉酶和胰脂肪酶抑制活性变化，探讨单宁酶处理提高茶梗提取物中儿茶素含量和生物活性可行性。研究发现：在 50条件下，利用 2 U/mL单宁酶溶液作用于茶梗粉末 60 min，茶梗提取液中酯型儿茶素（EGCG、ECG、GCG）基本被水解生成非酯型儿茶素（EGC、EC、GC）和没食子酸（GA），从而减少单宁-蛋白质聚合物和茶乳的形成量；此外，经单宁酶处理的茶梗提取液抗氧化活性与对照比较明显增强，表现为 OH 和 DPPH 自由基清除率 IC50分别降低了 74%和 26%；酶解茶梗提取液质量浓度为 5 000 mg/L 时，胰-淀粉酶和胰脂肪酶抑制率分别提高了 89%和 107%。研究结果表明单宁酶可高效水解茶梗提取液中酯型儿茶素，提高茶梗提取液的抗氧化活性以及体外抑制胰-淀粉酶和胰脂肪酶活性。关键词：酶，提取，生物活性，茶梗，儿茶素，转化 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.13.035 中图分类号：Q814.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2013)-13-0277-09 黄玉凤，肖安风，倪 辉，等.单宁酶处理提高茶梗儿茶素含量及茶梗提取液生物活性J.农业工程学报，2013，29(13)：277285.Huang Yufeng,Xiao Anfeng,Ni Hui,et al.Tannase treatment improves contents of catechins and bioactivity of tea stalk infusionJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(13):277285.(in Chinese with English abstract)0 引 言 茶在中国的历史悠久，但长期以来，人们只重视茶树芽叶的生产加工，而对茶末、茶梗等副产品的关注颇少。在茶生产加工过程中茶梗通常作为夹杂物被挑拣出来，年产量约占茶叶总量的 20%，仅福建安溪县一带就达 5 万 t。目前，大量茶梗还没有得到合理利用，大多用于茶园肥料或茶枕制作或置于屋内去除异味等，这造成资源很大浪费。其实茶梗与茶叶一样，含有许多对人体有益的成分，茶多酚1、儿茶素2、生物碱3-4、茶多糖5等。目前，市场上出现多种多样的茶饮料和保健茶，很多是从粗老茶、茶末、茶梗等副产品中提取营养保健成分，配入特殊药理功效的中草药、代用茶、特定的维生素和人体所需的微 收稿日期：2013-03-13 修订日期：2013-04-25.基金项目：福建省产学研重大专项项目（2010N5009）；集美大学科研创新团队基金项目（No.2010A006）；李尚大基金项目（ZC2011014）。作者简介：黄玉凤（1985），女，福建漳州人，研究方向：食品生物技术。厦门 集美大学生物工程学院，361021。通信作者：肖安风（1973），男，江西吉安人，集美大学生物工程学院副教授，博士，硕士生导师，主要从事食品生物技术。厦门 集美大学生物工程学院，361021。Email： 量元素等，再经特殊工艺处理制成的。因此，从茶梗原料中提取茶活性物质生产保健食品，是提高产品附加值，促进茶产业发展的有效途径。目前，茶叶有效成分提取方法主要有水浸提法和有机溶剂浸提法6。在水浸提过程中，添加外源酶辅助浸提有利于物料中有效成分的快速高效提取，从而提高生产效率6。单宁酶能切断没食子单宁中的酯键和缩酚键7，使具有苦涩味的酯型儿茶素被水解8，释放出的游离没食子酸又能与咖啡碱形成相对较小的水溶物9，这样不仅可减少或消除液态茶冷浑浊现象10，同时具有改善茶汤滋味的作用11，也可减轻茶叶浓缩液过滤时膜的污染和堵塞12，因此，单宁酶在有关茶饮料和茶产品开发中具有广泛的应用13，但利用单宁酶溶液辅助提取茶梗活性物质并分析单宁酶在改善茶梗提取液品质方面的研究还未见报道。本试验以福建安溪铁观音茶梗为原料，利用茶梗发酵得到的单宁酶溶液再次作用于茶梗，研究单宁酶对茶梗提取液儿茶素和生物活性的影响，为单宁酶在茶饮料行业中的应用和以茶梗作为提取原料的饮料行业提供理论依据。农业工程学报 2013 年 278 1 材料与方法 1.1 试验材料 茶梗：铁观音茶梗，购于福建省泉州市安溪县茶园。单宁酶溶液：由黑曲霉 JMU-TS528 固态发酵茶叶梗所得，培养基成分和发酵条件如下：每个250 mL 锥形瓶装 5 g 茶梗粉末，额外添加 NH4Cl和-乳糖的量均为 5%（质量分数），初始盐溶液pH 值为 6.0，固水比为 12（g/mL），搅拌均匀后，121灭菌 20 min，冷却后接种 4.35 mL 孢子悬液（1108个孢子/mL），28条件下发酵 118 h 后，每瓶加入 100 mL 柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲液（0.05 mol/L，pH 值 5.0），于 28下 180 r/min 振荡浸提 1 h 后过滤，即得粗酶液。提取得到的粗酶液经 1%活性炭脱色 1 h 后过滤，依次经过 0.8、0.45和 0.22 m 孔径的水相膜抽滤除菌。除菌后的酶液边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至 40%饱和度，低温静置 3 h，4，12 000 r/min 离心 20 min，收集上清液继续添加硫酸铵至 90%饱和度，低温静置3 h，4，12 000 r/min 离心 20 min，收集沉淀，用少 量 体 积 的 柠 檬 酸/柠 檬 酸 三 钠 缓 冲 液（0.01 mol/L，pH 值 5.0）对沉淀进行溶解后，4下透析 24 h。取透析后的酶液 4，12 000 r/min 离心 20 min，弃去不溶物，即得单宁酶溶液，测得酶活力为 2 U/mL，并分别用柠檬酸缓冲液稀释至所需浓度。酶活单位定义：30条件下每分钟产生1 mol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位。胰-淀粉酶：2 800 U/mg，购于上海国药集团有限公司。酶活力单位定义：37，pH 值 7.0 条件下每分钟产生 1 g 麦芽糖所需的酶量定义为一个酶活单位。胰脂肪酶：100400 U/mg，购于美国 Sigma公司。酶活力单位定义：37，pH 值 7.7 条件下水解甘油三酯每分钟生成 1 mol 脂肪酸所需的酶量定义为一个酶活单位。1.2 试验仪器 国家标准检验筛（80 目，浙江上虞市金鼎标准筛具厂）；高速药物粉碎机（山东青州精诚机械有限公司）；Centrifuge 5415D 小型高速离心机（德国 Eppendorf 公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（厦门精艺兴业科技有限公司）；AvantiTMJ-25 冷冻离心机（美国 Beckman 公司）；UV-2600A 型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；Waters 2695/2489 高效液相色谱仪（美国 Waters 公司）；Symmetry C18反相色谱柱（3.0250 mm，5 m，美国 Waters 公司）。1.3 试验方法 1.3.1 工艺流程 将茶叶梗粉碎，过 80 目的筛。按茶梗质量（g）与单宁酶溶液（mL），即料液比为 120 g/mL 的比例，称取茶梗粉末 1 g 添加 2 U/mL 的单宁酶溶液20 mL（pH 值 5.0），50振荡浸提 60 min 后，置于沸水浴 5 min 终止反应，趁热减压14过滤，并洗涤滤渣，定容至 50 mL，即单宁酶辅助浸提（酶辅浸提）的茶梗提取液（tea stalks infusion，TSI），相同条件下以去离子水浸提得到的 TSI 为对照。1.3.2 儿茶素检测方法 取处理后的 TSI 1 mL，10 000 r/min 离心10 min，经 0.22 m 微孔滤膜过滤后，备 HPLC 分析。液相色谱条件：symmetry C18（3.0250 mm，5 m）色谱柱；流动相为 0.5%乙酸水溶液（A）和甲醇（B），线性洗脱梯度为 88%A（0 min）-88%A（5 min）-81%A（16 min）-76%A（28 min）-70%A（32 min）-88%A（40 min）-88%A（45 min）；流速 0.5 mL/min；柱温 30；检测波长 278 nm。1.3.3 单宁-蛋白质聚合物分析 取 1 mL TSI 和 4 mL 染色 BSA 溶液混合，室温振荡 5 min，使完全混合。4 000 r/min 离心 20 min，弃上清，用 3.5 mL 十二烷基磺酸钠(SDS)-三乙醇胺-异丙醇溶液（1 g5 mL20 mL/100 mL）15溶解沉淀，摇匀使沉淀完全溶解，590 nm 处以水为空白调零，测量各样品的吸光值。1.3.4 茶乳含量测定 采用烘干法15测定。茶乳质量浓度（g/100 mL）以每 100 mL 提取液中沉淀的质量表示。1.3.5 还原力测定 采用还原 Fe3+的方法测定 TSI 的还原力16。1.3.6 OH 自由基清除率的测定 采用水杨酸法测定 TSI 清除羟自由基能力17。1.3.7 DPPH 自由基清除能力测定 利用比色法测定 TSI 清除 DPPH 自由基能力18。1.3.8 对胰-淀粉酶的抑制作用 参考张永军建立的方法19加以修改。取0.25 mL 胰-淀粉酶溶液（0.05 mg/mL）于测试管中（对照管加已失活的胰-淀粉酶），加入 0.25 mL TSI，37保温10 min，加入0.5 mL质量分数为0.5%淀粉溶液。反应 30 min 后立即加入 1 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，沸水浴 8 min，冷却后加水定容至 10 mL，以水为空白调零，540 nm 处测吸第 13 期 黄玉凤等：单宁酶处理提高茶梗儿茶素含量及茶梗提取液生物活性 279 光度A。根据麦芽糖标准曲线，由测试管和对照管吸光值的变化计算麦芽糖生成量：A540=A测试管A对照管，从而求出胰-淀粉酶活力（T2，U）。以磷酸缓冲液（0.02 mol/L，pH 值 7.0）代替茶梗提取液，测定不加抑制剂（茶梗提取液）情况下的胰-淀粉酶活力（T1，U）。根据加入抑制剂前（T1）后（T2）酶活力的变化求出抑制率，绘制抑制率-TSI 浓度曲线。抑制率 E（%）=(T1T2)/T1100。1.3.9 对胰脂肪酶的抑制作用 参考张永军建立的方法19加以修改。取 l mL TSI 与 l mL 胰脂肪酶溶液（2 mg/mL）混合，对照加已失活的胰脂肪酶，37预热 5 min，加入已预热至同样温度的底物（0.05 mol/L，pH 值 7.7 的磷酸缓冲液 4 mL 加 2 mL 橄榄油），37下，搅拌30 min，立即加入 10 mL 二甲苯，继续搅拌 5 min，终止反应，同时萃取脂肪酸。转移至离心试管中，4 000 r/min 离心 10 min，取上层有机相 4 mL 于小锥形瓶中，加入 1 mL 显色剂（质量分数 5%醋酸铜溶液，用吡啶调节 pH 值=6.1），振荡 5 min，4 000 r/min 离心 10 min 后取上层有机相于 710 nm处测吸光值。另取 1 mL 缓冲溶液替代茶梗提取液，测定不加抑制剂条件下胰脂肪酶活力。对照脂肪酸标准曲线求出胰脂肪酶活力，酶活计算及抑制率计算公式同胰-淀粉酶测定。1.3.10 统计方法 试验结果均以 4 次平行测定的均值表示，数据使用 SPSS 17.0 进行方差分析，差异性分析采用邓肯多范围检测法，相同字母表示差异不显著，不同字母表明差异显著（P0.05）。2 结果与分析 2.1 酶添加量对茶梗儿茶素的影响 茶梗固态发酵制备的酶液，经适当纯化后单宁酶活力为 2 U/mL，稀释至不同浓度后用于辅助提取茶梗活性物质，制得的茶梗提取液（tea stalk infusion，TSI）中儿茶素总量及其组成均有所改变（表 1）。由表 1 可知，随着单宁酶添加量的增加，儿茶素总量总体呈现逐渐减少的趋势，酯型儿茶素（EGCG、GCG、ECG）大幅减少，其中，由于 EGCG的含量大，减少的幅度也最大，非酯型儿茶素（EGC、GC、EC）增加明显，同时没食子酸（GA）含量显著增加，说明在单宁酶的作用下酯型儿茶素分解转化为非酯型儿茶素，同时释放出 GA。表 1 不同单宁酶浓度对茶梗儿茶素的影响 Table 1 Effects of tannase concentrations on catechins in TSI 儿茶素类质量浓度 Contents of catechins/(gmL-1)单宁酶浓度 Concentration of Tannase/(UmL-1)没食子酸 GA/(gmL-1)没食子儿茶素 GC 表没食子儿茶素 EGC 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG 表儿茶素EC 没食子儿茶素没食子酸酯GCG 表儿茶素没食子酸酯 ECG 非酯型儿茶素 Nonestern catechins 酯型儿茶素 Estern catechins 儿茶素总量 Total catechins0 35.88d 4.39b 157.55c 329.82a 48.23c 6.71a 85.13a 210.16c 421.66a 631.83ab 0.4 244.07c 4.67a 374.99b 106.44b 96.00b 0.00b 61.37b 475.66b 167.81b 643.47a 0.8 305.20b 3.64c 413.42a 34.51c 103.87ab0.00b 49.06c 520.93a 83.57c 604.50abc 1.2 337.21a 3.34d 431.97a 14.74d 108.56a0.00b 43.69c 543.88a 58.43d 602.31bc 1.6 340.73a 3.41cd 429.56a 11.54d 109.50a0.00b 43.44c 542.47a 54.98d 597.45bc 2 351.44a 3.59c 434.44a 0.00e 112.54a0.00b 37.82d 550.57a 37.82e 588.39c 注：同一列不同字母表示差异性显著（P0.05）。料液比为 1:20 g/mL，酶作用温度为 50，酶作用时间为 60 min。非酯型儿茶素含量=GC+EGC+EC；酯型儿茶素含量=EGCG+GCG+ECG。Note:The different letters in the same column indicates significant difference(P0.05).The ratio of tea stalk to enzyme:1:20 g/mL,temperature:50C,time:60 min.Content of nonestern catechins=GC+EGC+EC;Content of estern catechins=EGCG+GCG+ECG.2.2 酶作用温度对茶梗儿茶素的影响 试验考察了不同温度对单宁酶作用于茶梗儿茶素的影响，结果如表 2 所示。从表 2 可以看出，在相对低温（3050）条件下，儿茶素总量、非酯型儿茶素和 GA 含量明显增加，酯型儿茶素含量也显著增加，推测原因是在该条件下酯型儿茶素的溶出速率小于酶解速率。随着温度（4060）的升高，酯型儿茶素的含量显著减少，非酯型儿茶素和 GA 含量持续增加，说明适当提高温度有利于物质的溶出和酶解作用的增强，该现象以 EGCG 含量的变化最为明显。2.3 酶作用时间对茶梗儿茶素的影响 提取液中儿茶素的含量随酶作用时间的变化规律如表 3 所示。同样地，随着酶作用时间的延长，酯型儿茶素的分解程度增大，其总量持续减少，非酯型儿茶素和 GA 的含量增加。在反应初始时，茶梗一接触酶液立即过滤仍然有少量儿茶素的存在，推测原因是一些易溶于水的物质一接触酶液就立即释放出来的缘故。随着时间的延长，物质溶出速率小于酶解速率，酯型儿茶素逐渐减少，非酯型儿茶素不断增加。75 min 时，大部分酯型儿茶素已基本被水解，单宁酶酶解反应速率逐渐降低。农业工程学报 2013 年 280 表 2 不同酶作用温度对茶梗儿茶素的影响 Table 2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on catechins in TSI 儿茶素类质量浓度 Contents of catechins/(gmL-1)温度 Temperature/没食子酸 GA/(gmL-1)没食子儿茶素 GC 表没食子儿茶素 EGC 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG 表儿茶素EC 没食子儿茶素没食子酸酯 GCG 表儿茶素没食子酸酯 ECG 非酯型儿茶素 Nonestern catechins 酯型儿茶素 Estern catechins 儿茶素总量Total catechins30 230.35d 3.50c 374.40a 0.00d 78.16b4.49a 17.17d 456.06b 21.65c 477.71b 40 254.21c 3.87c 383.60a 37.80a 96.22a 4.51a 28.88c 483.68ab 71.19a 554.87a 50 303.42b 5.12a 420.16a 25.71b 107.84a3.78c 41.06a 533.12a 70.55a 603.67a 60 326.61a 4.48b 414.92a 5.89c 102.61a4.18b 35.30b 522.01a 45.37b 567.38a 注：同一列不同字母表示差异性显著（P0.05）。料液比为 1:20 g/mL，酶添加浓度为 2 U/mL，酶作用时间为 60 min。非酯型儿茶素含量=GC+EGC+EC；酯型儿茶素含量=EGCG+GCG+ECG。Note:The different letters in the same column indicates significant difference(P0.05).The ratio of tea stalk to enzyme:1:20 g/mL,tannase concentration:2 U/mL,time:60 min.Content of nonestern catechins=GC+EGC+EC;Content of estern catechins=EGCG+GCG+ECG.表 3 不同酶作用时间对茶梗儿茶素的影响 Table 3 Effects of enzymatic hydrolysis time on catechins in TSI 儿茶素类质量浓度 Contents of catechins/(gmL-1)时间 Time/min 没食子酸 GA/(gmL-1)没食子儿 茶素 GC 表没食子儿茶素 EGC 表没食子儿茶素没食子酸酯 EGCG 表儿茶素EC 没食子儿茶素没食子酸酯GCG 表儿茶素没食子酸酯ECG 非酯型儿茶素 Nonestern catechins 酯型儿茶素 Estern catechins 儿茶素总量Total catechins0 107.59f 1.68d 281.01d 0.00d 39.31e 0.00d 3.83e 321.99d 3.83e 325.82d 15 169.85e 8.01a 310.46cd 206.51a 83.15d 5.29a 63.62a 401.61c 275.42a 677.03a 30 211.53d 6.84b 326.39c 146.09b 86.38cd4.52bc 58.04b 419.61c 208.65b 628.25ab 45 262.09c 6.82b 374.44b 103.31c 94.71bc4.21c 42.75c 475.96b 150.27c 626.23ab 60 337.74b 3.78c 398.69b 6.93d 101.53b4.55b 31.68d 504.00b 43.16d 547.16c 75 377.08 4.09c 453.28a 0.00d 117.82a4.28bc 3.37e 575.20a 7.65e 582.85bc 90 374.39 4.28c 445.36a 0.00d 114.10a4.25bc 2.76e 563.74a 7.01e 570.76bc 注：同一列不同字母表示差异性显著（P0.05）。料液比为 1:20 g/mL，酶添加浓度为 2 U/mL，酶作用温度为 50。非酯型儿茶素含量=GC+EGC+EC；酯型儿茶素含量=EGCG+GCG+ECG。Note:The different letters in the same column indicates significant difference(P0.05).The ratio of tea stalks to enzyme:1:20 g/mL,tannase concentration:2 U/mL,temperature:50C.Content of nonestern catechins=GC+EGC+EC;Content of estern catechins=EGCG+GCG+ECG.2.4 单宁酶对茶梗儿茶素的作用试验 对传统沸水提取和单宁酶处理条件下制得的TSI 中儿茶素组成进行比较（表 4）。从表 4 可以看出，单宁酶辅助提取的 TSI 儿茶素总量较传统沸水提取方法增加了 11.5%，儿茶素组成变化极显著，其中，酯型儿茶素总量减少了 94%，非酯型儿茶素增加了 156%，同时 GA 的含量增加了 684%，说明单宁酶可高效水解复杂儿茶素形成简单儿茶素，同时释放出 GA。表 4 沸水提取与单宁酶处理条件下儿茶素的质量浓度 Table 4 Contents of catechins under the conditions of boiling water and tannase-treated 儿茶素类质量浓度 Contents of catechins/(gmL-1)处理方法 Treatment 没食子酸 GA/(gmL-1)没食子儿茶素 GC 表没食子儿茶素 EGC 表没食子儿茶素没食子酸酯 EGCG 表儿茶素EC 没食子儿茶素没食子酸酯 GCG 表儿茶素没食子酸酯 ECG 非酯型儿茶素 Nonestern catechins 酯型儿茶素 Estern catechins 儿茶素总量Total catechins沸水提取 Boiling water extracted 44.07b 4.89b 142.82b 211.35a 55.09b 46.59a 19.88a 202.81b 277.82a 480.63b 单宁酶处理 Tannase treated 345.55a 6.38a 413.66a 12.41b 99.45a 4.17b 0.00b 519.49a 16.58b 536.07a 注：同一列不同字母表示差异性显著（P0.05）。沸水提取：沸水浴浸提 30 min；酶解条件：酶浓度 2 U/mL，酶作用温度 50，酶作用时间 60 min，下同。非酯型儿茶素含量=GC+EGC+EC；酯型儿茶素含量=EGCG+GCG+ECG。Note:The different letters in the same column indicates significant difference(P0.05），而未经酶解的茶乳形成量呈现增加趋势，这说明单宁酶的添加有利于减缓 TSI 茶乳形成和提高 TSI 的稳定性。a.室温（25C）b.低温（4C）图 2 室温和低温储存过程单宁酶酶解对 TSI 茶乳形成量的影响 Fig.2 Effect of enzymatic treatment on formation of tea cream for TSI during storage under room temperature and low temperature 2.7 单宁酶对茶梗提取液生物活性的影响 2.7.1 对还原力的影响 一般来说，物质的抗氧化能力与还原能力有正相关关系。在本试验中，样品的吸光值 A 越大，说明其还原能力越强，抗氧化能力也就越强。由图 3可看出，随 TSI 浓度的增大吸光值逐渐增大，且经单宁酶处理的 TSI 吸光值增大趋势大于对照组，由此可见茶梗提取液经单宁酶处理后还原能力增强，且具有明显的剂量依赖性，表现为 0800 mg/L 的质量浓度范围内吸光值几乎呈线性增大。图 3 TSI 酶解前后的还原能力 Fig.3 Reducing capacity of TSI with or without tannase treatment 农业工程学报 2013 年 282 2.7.2 对 OH 自由基清除率的影响 羟自由基是细胞新陈代谢过程中产生的一种毒性很强的自由基，存在人体内的时间很短，但具有很高的活性，与人体的病变、衰老有重要关系。不同浓度 TSI 对 OH 自由基的清除效果如图 4 所示。研究结果表明，酶解前后的 TSI 对 OH 自由基均具有清除作用。随着提取液质量浓度的增加，未经单宁酶作用的TSI 清除率逐渐上升，而经单宁酶处理的清除率在低浓度下迅速上升，当浓度大于 3000 mg/L 时，OH 自由基的清除率趋于饱和并呈现稳定状态。图 4 TSI 酶解前后对 OH 自由基的清除效果 Fig.4 OH scavenging effect of TSI with or without tannase treatment IC5018常用于评价样品的抗氧化能力和自由基清除能力，它指的是当清除率为 50%时样品的质量浓度，其值越小，自由基清除能力越强，即样品的抗氧化活性越强。在本试验中，根据数据拟合曲线方程计算得到：经单宁酶处理的 TSI 清除 OH 自由基的 IC50为 1 085 mg/L，而未经单宁酶处理的 IC50为 4 192 mg/L，酶解后的半清除浓度较对照组降低了 74%，这表明，TSI 经单宁酶水解后，其清除 OH自由基的能力显著提高了。2.7.3 对 DPPH 自由基清除率的影响 DPPH是一种稳定反磁性分子的自由基，它能够很好地捕获电子和氢质子，常作为评价抗氧化剂清除自由基能力的底物25。试验考察了 TSI 对DPPH 自由基的清除效果（图 5）。图 5 TSI 酶解前后对 DPPH 自由基的清除效果 Fig.5 DPPH scavenging effect of TSI with or without tannase treatment 从图 5 可以看出，在 1080 mg/L 范围内，TSI对 DPPH 自由基的清除能力有较好的量效关系，随着提取液质量浓度的增大，其清除能力逐步增强，且经单宁酶处理的 TSI 清除率显著高于对照组。同时，根据数据拟合曲线方程计算得到：试验组清除DPPH自由基的IC50为43 mg/L较对照组（58 mg/L）降低了 26%，这说明，经单宁酶水解后，TSI 表现出较强的清除 DPPH 自由基能力。2.7.4 对胰-淀粉酶抑制作用的影响-淀粉酶抑制剂可以有效地抑制唾液及肠道内胰-淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，在不影响其他营养物质吸收和代谢的同时，减少糖分的吸收，降低血糖和血脂的水平，从而胰岛素分泌减少及脂肪合成降低，临床上常用于防治高血糖、高血脂、糖尿病、肥胖症等疾病26，因此研究-淀粉酶抑制剂具有重要的现实意义。由图 6，TSI 对胰-淀粉酶的抑制率曲线可知，不同浓度的 TSI 对胰-淀粉酶均具有抑制作用，且两者呈正相关关系。在低浓度（约 2 000 mg/L）下，经单宁酶处理的 TSI 抑制率略小于对照组，随着浓度的增大，前者的抑制效果显著增强，且明显大于对照组，这可能是因为随着酶解反应的进行，茶多酚的主体物质儿茶素类含量有所增加的原因。在5 000 mg/L 的 TSI 质量浓度下，酶解前后 TSI 对胰-淀粉酶抑制率分别为 19%、36%，相比提高了89%。图 6 TSI 酶解前后对-淀粉酶的抑制作用 Fig.6 Effect of TSI with or without tannase treatment on inhibition rate of pancreatic-amylase activity 2.7.5 对胰脂肪酶的抑制作用 食物中的脂肪被胰脂肪酶降解为单酰甘油和游离脂肪酸后，在肠道被吸收，然后在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终可导致肥胖。近年来，治疗肥胖症的各种方法中有许多是通过抑制胰脂 肪酶的活性，从而达到减少脂肪的吸收、控制和治疗肥胖的目的27。从图 7 可知，无论是经单宁酶处理还是未经单宁酶处理的 TSI 对胰脂肪酶均具有抑第 13 期 黄玉凤等：单宁酶处理提高茶梗儿茶素含量及茶梗提取液生物活性 283 制作用，但经单宁酶水解的 TSI 抑制作用明显强于对照。在一定质量浓度下，TSI 对脂肪酶的抑制率呈上升趋势，经单宁酶水解的提取液抑制率曲线在初期上升幅度大后趋于平缓，对照组抑制率一直处于缓慢上升的状态。当 TSI 质量浓度为 5 000 mg/L时，经单宁酶处理的 TSI 对胰脂肪酶抑制率为60%，比未经单宁酶处理的（29%）提高了 107%。图 7 TSI 酶解前后对胰脂肪酶的抑制作用 Fig.7 Effect of TSI with or without tannase treatment on inhibition rate of pancreatic lipase activity 3 结 论 单宁酶可高效水解茶梗提取液中酯型儿茶素，生成非酯型儿茶素和没食子酸。相比传统沸水提取方法，2 U/mL 单宁酶溶液 50下辅助浸提茶梗粉末 60 min，所得的茶梗提取液中儿茶素组分变化极显著，儿茶素总量增加 11.5%，酯型儿茶素减少了94%，而简单儿茶素和没食子酸分别增加了 156%和 684%。同时，酶解的茶梗提取液单宁-蛋白质聚合物和茶乳的形成量明显减少。此外，与水提的茶梗提取液相比，单宁辅助提取的茶梗提取液抗氧化活性和体外抑制胰-淀粉酶和胰脂肪酶活性明显增强，其中 OH 和 DPPH 自由基清除率 IC50分别降低了 74%和 26%；当茶梗提取液质量浓度为5 000 mg/L 时，酶解茶梗提取液对胰-淀粉酶和胰脂肪酶抑制率分别提高了 89%和 107%。参 考 文 献 1 汪兴平，周志，莫开菊，等.茶叶有效成分复合分离提取技术研究J.农业工程学报，2002，18(6)：131136.Wang Xingping,Zhou Zhi,Mo Kaiju,et al.Comprehensive extraction technologies of active constituents of teaJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2002,18(6):131 136.(in Chinese with English abstract)2 Dong Junjie,Ye Jianhui,Lu Jianliang,et al.Isolation of antioxidant catechins from green tea and its decaffeinationJ.Food and Bioproducts Processing,2011,89(1):6266.3 İen H,Gr M.Extraction of caffeine from tea stalk and fiber wastes using supercritical carbon dioxideJ.The Journal of 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