A1核酸化学DNA2004.pptx

复旦大学生物化学系黄伟达Watson-Crick的的DNA双螺旋双螺旋2.0 nm2.0 nm结结结结构构构构特特特特征征征征复旦大学生物化学系黄伟达双螺旋分子中糖双螺旋分子中糖双螺旋分子中糖双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，分子与纵轴平行，分子与纵轴平行，分子与纵轴平行，与碱基平面垂直与碱基平面垂直与碱基平面垂直与碱基平面垂直稳定双螺旋结稳定双螺旋结稳定双螺旋结稳定双螺旋结构的作用力为构的作用力为构的作用力为构的作用力为氢键和碱基堆氢键和碱基堆氢键和碱基堆氢键和碱基堆积力（即疏水积力（即疏水积力（即疏水积力（即疏水作用）作用）作用）作用）复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA的分子形状的分子形状原核生物的基因组原核生物的基因组DNA（即染色体）即染色体）、质粒（、质粒（plasmid）DNA，和一些和一些病毒病毒DNA，呈环状。呈环状。真核生物的染色体真核生物的染色体DNA，大部分噬大部分噬菌体菌体DNA，和一些病毒和一些病毒DNA，呈线呈线状。状。复旦大学生物化学系黄伟达环状环状DNA引发的引发的拓扑学问题拓扑学问题复旦大学生物化学系黄伟达细菌质粒细菌质粒DNADNA的不同状态的不同状态松弛型松弛型松弛型松弛型超螺旋超螺旋超螺旋超螺旋部分解链部分解链部分解链部分解链复旦大学生物化学系黄伟达正螺旋和负螺旋正螺旋和负螺旋DNADNA双螺旋为右旋螺双螺旋为右旋螺旋。细胞中的旋。细胞中的环状环状DNADNA一般呈负超螺旋，一般呈负超螺旋，即右旋螺旋不足导致即右旋螺旋不足导致部分碱基不形成配对，部分碱基不形成配对，分子通过整体拓扑学分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋上的右旋来补足右旋螺旋的不足，在数学螺旋的不足，在数学上呈上呈1 1：1 1，即分子整，即分子整体右旋一圈来补双螺体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。旋上的一圈不足。正超螺旋为双螺旋旋正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整转过度，通过分子整体的左旋来解去过度体的左旋来解去过度的螺旋。的螺旋。正超螺旋正超螺旋正超螺旋正超螺旋 左旋左旋左旋左旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋 右旋右旋右旋右旋复旦大学生物化学系黄伟达不同形状的不同形状的DNADNA分子在琼脂糖中的迁移率分子在琼脂糖中的迁移率松弛型，松弛型，OC,Open circular DNA超螺旋超螺旋,CCC,covalently-closed circular DNALinear DNA从细菌抽提从细菌抽提得到的质粒得到的质粒DNA 样品样品中不含线状中不含线状DNA复旦大学生物化学系黄伟达从大肠杆菌用常规方法得到的质粒从大肠杆菌用常规方法得到的质粒DNA经常是这个样子经常是这个样子?电电泳泳方方向向线性化前线性化前线性化前线性化前线性化后线性化后线性化后线性化后复旦大学生物化学系黄伟达 DNA DNA复制过程中复制过程中形成的链状分子形成的链状分子(catenanes)(catenanes)需需要拓扑酶来帮助要拓扑酶来帮助解离解离复旦大学生物化学系黄伟达真核生物的真核生物的DNA不裸露不裸露平均每平均每200bp的的DNA绕核小绕核小体左旋体左旋1.75转，因此真核生转，因此真核生物的物的DNA分子为正超螺旋分子为正超螺旋复旦大学生物化学系黄伟达DNA的一级结构分析的一级结构分析复旦大学生物化学系黄伟达DNA的序列测定（的序列测定（1 1）化学法化学法Maxam/GilbertMaxam/Gilbert法法法法复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA的序列测定（的序列测定（2 2）ddNTPddNTP法法Sanger法法复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA测序结果测序结果复旦大学生物化学系黄伟达 到到20302030年，预计只要年，预计只要10001000美金就能得到个人的基因组美金就能得到个人的基因组序列。刷卡看病的时代即将序列。刷卡看病的时代即将到来。到来。注：注：人与人之间平均人与人之间平均 10001000个碱基对就个碱基对就有一个碱基呈多态性有一个碱基呈多态性(SNP)(SNP)。因此共在。因此共在300 300 万个碱基上可能存在差异。万个碱基上可能存在差异。SNP：singlenucleotidepolymorphism复旦大学生物化学系黄伟达DNA重组技术的基础重组技术的基础复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA与与限制性内切酶限制性内切酶双链双链DNADNA分子可以被上分子可以被上千种从微生物中分离得千种从微生物中分离得到的限制性内切酶到的限制性内切酶（restriction restriction enzymeenzyme）切断切断,又可以又可以再连接起来。切断的过再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接程不需要能量，而连接的起来的过程却需要的起来的过程却需要2 2个分子的个分子的ATPATP。这就是这就是分子克隆和分子克隆和DNADNA重组技重组技术的基础。术的基础。复旦大学生物化学系黄伟达大部分限制性大部分限制性内切酶识别的内切酶识别的碱基序列均为碱基序列均为 6 6 个碱基的个碱基的palindrome palindrome 顺顺序。它们在微序。它们在微生物细胞内扮生物细胞内扮演的却是防御演的却是防御外来外来DNADNA入侵的入侵的国防军的作用。国防军的作用。如何不把自身如何不把自身的的DNADNA也降解了也降解了呢？呢？复旦大学生物化学系黄伟达复旦大学生物化学系黄伟达DNA重组示意图重组示意图EcoRI与与DNA的复合体的复合体复旦大学生物化学系黄伟达DNA的变性与复性的变性与复性人基因组中重复序列的发现人基因组中重复序列的发现复旦大学生物化学系黄伟达分子的变性分子的变性复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA的变性在紫外吸收上的变化的变性在紫外吸收上的变化1.37倍倍Hyperchromic effect Hyperchromic effect Hyperchromic effect Hyperchromic effect 增色效应增色效应增色效应增色效应1 OD260 DS DNA 50 g SS DSA 37 g RNA 40 g不同来源不同来源不同来源不同来源DNADNADNADNA的变性曲线的变性曲线的变性曲线的变性曲线复旦大学生物化学系黄伟达盐浓度对盐浓度对DNADNA变性的影响变性的影响复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA分子的分子的TmTm与与GCGC含量有关含量有关复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA浓度与复性时间的关系浓度与复性时间的关系T1/2 C const复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA复性与复性与CotCot分析分析复旦大学生物化学系黄伟达CotCot曲线的另一种表达形式曲线的另一种表达形式复旦大学生物化学系黄伟达人人DNA的的Cot曲线曲线 哺乳动物的哺乳动物的DNA 一般均一般均呈右图的曲线，呈右图的曲线，这是因为它们这是因为它们的基因组的基因组DNA 中插入了大量中插入了大量的重复序列，的重复序列，如人的如人的DNA中中就插入了长度就插入了长度为为350bp的的Alu序列达序列达50万份万份拷贝之多。拷贝之多。复旦大学生物化学系黄伟达分子杂交、分子杂交、PCR等技术等技术复旦大学生物化学系黄伟达DNADNA的分子杂交技术的分子杂交技术复旦大学生物化学系黄伟达聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）原理原理PCR是应用是应用最广的分子最广的分子生物学技术，生物学技术，在在DNA测序测序中只用了单中只用了单链扩增技术，链扩增技术，所产生的模所产生的模板板DNA并不并不指数上升，指数上升，而只以热循而只以热循环数为倍数。环数为倍数。复旦大学生物化学系黄伟达足迹法原理足迹法原理(Footprinting)(Footprinting)复旦大学生物化学系黄伟达利用足迹法确定利用足迹法确定 RNA RNA 聚合酶结合聚合酶结合位点的实验位点的实验