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RNA干扰下调NF
【摘要】 目的 运用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术下调胰腺癌细胞株PANC-1中NF-κB p65基因表达，并评价其对肿瘤细胞凋亡的影响。方法 利用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)转染入胰腺癌细胞株PANC-1中。采用RT-PCR法测定细胞内NF-κB p65mRNA的表达，酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变，运用Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测p65基因表达下调对PANC-1细胞凋亡的影响。结果 化学合成的人NF-κB p65 siRNA能有效地抑制PANC-1细胞中NF-κB p65mRNA的表达()，同时ELISA结果显示，RelA siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组()。Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测发现下调p65基因表达能够诱导PANC-1细胞的凋亡。结论 体外实验初步证明了NF-κB p65基因在胰腺癌细胞凋亡调控方面扮演重要角色，通过沉默其表达可诱导胰腺癌细胞的凋亡。
【关键词】 RNA干扰 -κB PANC-1细胞 细胞凋亡 胰腺肿瘤
Abstract Objective To observe the apoptotic effects of RNAi-mediated NF-κB p65 gene on silencing pancreatic carcinoma cell strain PANC-1. Methods Chemically synthesized small interference RNA (siRNA) directed against human NF-κB p65 was transfected into pancreatic carcinoma cell PANC-1 using cationic liposome LipofectamineTM 2000 as the transfecting agent. The expression of NF-κB p65 gene was detected by RT-PCR technique. The DNA binding activity of NF-κB was detected by the chemicon non-radioactive NF-κB p65 transcription factor assay kit. Nuclear DNA staining by Hoechst 33258， flow cytometry， transmission electron microscope was used to ascertain whether cell apoptosis could be induced by down-regulating the expression of p65 gene in PANC-1 cell. Results The results of RT-PCR indicated that chemically synthesized siRNA directed against human NF-κB p65 could knock down the transcription and expression of NF-κB p65 gene. The difference between the RelA siRNA group and control groups was significant (). After transfection， the DNA binding activity of NF-κB p65 in RelA siRNA group was much lower than that of the control groups (). Nuclear DNA staining by Hoechst 33258， flow cytometry， transmission electron microscopy showed that knockdown of p65 expression by RNAi induced apoptosis in PANC-1 cell. Conclusion The study provides basis for researching the function of NF-κB p65 gene， indicating down-regulating the expression of p65 gene by RNAi may induce apoptosis in pancreatic carcinoma cell strain PANC-1.
Key words RNA interference； NF-κB； PANC-1 cell； apoptosis； pancreatic neoplasmsNF-κB(nuclear factor-kappa B)是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子，是控制早期基因表达的基因开关[1]。人胰腺癌细胞中NF-κB存在选择性激活，其中以p65组成性活化为主，这与胰腺肿瘤的致瘤转化、侵袭、转移、凋亡抵抗等行为是密切相关的。本研究通过设计针对人NF-κB p65的siRNA，采用阳离子脂质体作为转染试剂，观察siRNA导入后对人胰腺癌细胞株PANC-1内NF-κB p65表达的抑制作用，并评价其对肿瘤细胞凋亡的影响。
1 材料和方法
　材料
　试剂 OPTIMEM转染液、LipofectamineTM 2000试剂盒为美国Invitrogen公司产品。TRIzol试剂、高糖型DMEM培养液为美国GIBCO公司产品。M-MLV逆转录试剂盒、PCR引物为德国QIAGEN公司产品。Annexin V/FITC凋亡试剂盒为美国BD公司产品。非放射性NF-кB p65转录因子检测试剂盒、核蛋白抽提及定量试剂盒为美国Chemicon公司产品。
　细胞 PANC-1细胞(人胰腺癌细胞株)购于中国科学院上海细胞库。
　仪器 Jem1010透射电子显微镜为日本JEOL公司产品。倒置荧光显微镜为日本Olympus公司产品。FACSCalibur型流式细胞仪为美国BD公司产品。PCR仪、凝胶成像系统为美国PE公司产品。ELX800UV型酶标仪为美国BioTek公司产品。
　方法
　siRNA序列的设计合成 通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)的GenBank数据库搜索人NF-κB p65的cDNA序列(基因登录号M62399)，根据Elbashir等提出的目标序列选取原则，经美国Invitrogen公司的在线设计软件RNAi express筛选目标干扰序列，使用BLAST将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，确定人NF-κB p65的siRNA目标寡核苷酸序列：5′-TCCTTTCAGGAGATGAAGACT-3′，进而设计人NF-κB p65的stealthTMsiRNA：正义5′-AAACUCAUCAUAGUUGAUGGUGCUC-3′，反义5′-GAGCACCAUCAACUAUGAUGAGUUU-3′(产品编号：116958E01-02)。设立阴性对照stealthTM siRNA(negative control siRNA)，同样行BLAST比对检查以保证它和目标靶细胞中其他基因没有同源性。negative control siRNA为36％GC含量(产品编号：12935-100)。stealthTM siRNA由美国Invitrogen公司化学合成。
　siRNA-LipofectamineTM 2000混合物的制备
为提高转染效率，根据LipofectamineTM 2000试剂盒说明对stealthTM siRNA和LipofectamineTM 2000的用量进行了优化实验，最终选用 stealthTM siRNA 的浓度为100 pmol，LipofectamineTM 2000体积为5 μl作为每孔细胞的转染剂量。两者分别用250 μl的OPTIMEM转染液稀释，在25 min内将已经稀释的stealthTM siRNA和LipofectamineTM 2000混匀，室温下保温孵育20 min以备转染细胞。
　siRNA的转染 转染前1 d，在标准六孔板中按×105个/孔的数量接种PANC-1细胞，加入不含抗生素的适量高糖型DMEM培养液(含10％的胎牛血清)，转染时细胞的汇合度要达到60％～70％。实验分为3组：空白对照组；阴性对照组(每个细胞孔内加入含5 μl LipofectamineTM 2000和100 pmol stealthTM negative control siRNA的稀释混合物)；RelA siRNA组(每个细胞孔内加入5 μl LipofectamineTM 2000和100 pmol NF-κB p65 stealthTM siRNA的稀释混合物)。每组实验重复6次。
　RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达水平 于转染后24 h，用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，分光光度计检测RNA浓度及纯度，各取1 μgRNA逆转录为cDNA，取2 μl cDNA以NF-κB p65的引物(上游引物5′-GGGAAGGAACGCTGTCAGAG-3′，下游引物5′-TAGCCTCAGGGTACTCCATCA-3′，扩增片断约204 bp)和内参照β-actin的引物(上游引物5′-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′，扩增片断约275 bp)进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μl， NF-κB p65的扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸45 s，进行25个循环，72℃末次延伸10 min。最后取扩增产物 10 μl在含 μg/ml溴乙锭的%琼脂糖凝胶上电泳，产物条带用凝胶成像系统照相并进行灰度分析。目的片段的相对表达量=目的基因的灰度值/ β-actin的灰度值。
　ELISA法检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性 于转染后48 h，提取各组细胞的核蛋白进行蛋白定量(BCA法)，根据测得的蛋白浓度，稀释各蛋白样品为5 mg/ml，用非放射性NF-кB p65转录因子检测试剂盒检测p65的DNA结合活性，按试剂盒说明书进行操作。方法分别在 ml微量离心管中准备样本，样本分为待检样本(含待测核蛋白与NF-кB p65捕获探针)、阳性对照样本(含NF-кB p65捕获探针与TNF-α刺激的Hela细胞总蛋白)、竞争寡核苷酸对照样本(含待测核蛋白与NF-кB p65捕获探针及竞争寡核苷酸)、阴性对照样本(含待测核蛋白与TFA阴性对照探针)。将各管50 μl样本分别加入到96孔TFA板上的微孔中，室温孵育 1～2 h，洗板3次后每孔加入100 μl稀释的兔抗NF-кB p65一抗，室温孵育1 h。洗板后每孔加入100 μl稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育30 min。再次洗板后每孔加入100 μl TMB/E酶作用底物，37℃孵育10 min后每孔加入100 μl终止液，进行比色分析用酶标仪检测450 nm波长处吸光度A值。颜色深浅与NF-кB的DNA结合活性成正比，根据颜色深浅即可检测p65亚单位与DNA结合活性的变化。
　Hoechst33258核染色观察细胞凋亡 细胞培养时制备细胞爬片，于转染后48 h，各组细胞培养孔内均加入30 mg/L的荧光染料Hoechst33258，继续培养24 h后取出爬片在倒置荧光显微镜下观察细胞核的染色强度和核形态，并据之以评价细胞的凋亡情况。
　流式细胞术检测细胞凋亡 实验分组同上，转染后48 h，消化各孔PANC-1细胞，冷PBS洗涤 2遍，调整细胞浓度为3×105个/ml，加入250 μl结合缓冲液重悬。取100 μl 细胞悬液于5 ml流式管中，加入5 μl的膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素(Annexin-V-FITC)和10 μl浓度为20 μg/ml的碘化丙啶(PI)染色，混匀后室温避光孵育15 min，在反应管中加入400 μl的PBS，上流式细胞仪检测细胞凋亡。
　透射电子显微镜观察凋亡细胞的超微结构
转染后72 h，消化收集各组细胞，冷PBS洗涤2遍，加4℃预冷的3%戊二醛固定，再次洗涤后加入4℃预冷的1%锇酸固定1 h，吸出固定剂，乙醇梯度脱水，干燥后真空喷镀，其后在Jem1010透射电镜80 kV加速电压下观察细胞超微结构的改变。
　统计学方法 采用SPSS 统计分析软件进行数据分析，计量资料的均数用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNK-q检验。提示差异有统计学意义。
　　2 结果
　各组细胞内NF-κB p65mRNA水平的变化 RT-PCR的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示RelA siRNA组、阴性对照组和空白对照组均在204 bp处有特异性的NF-κB p65 mRNA表达条带(见图1)。NF-κB p65mRNA相对表达量分别为±，±和±；RelA siRNA组NF-κB p65mRNA表达明显低于阴性对照组和空白对照组()，而阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义。
　各组细胞内NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的变化 ELISA法检测结果见表1。RelA siRNA组与阴性对照组及空白对照组比较，差异有统计学意义()，而阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义。
　Hoechst33258核染色观察结果 RelA siRNA组中细胞体积变小，细胞核皱缩呈致密浓染，染色质碎裂呈块状并有边集现象，核染色强度变淡，而阴性对照组与空白对照组的细胞核染色强度及形态大小均相对正常(见图2)。
　流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平的变化 RelA siRNA组的细胞凋亡率明显增高，为(±)%，与对照组相比差异有统计学意义()。空白对照与阴性对照组的凋亡率分别为(±)%，(±)%，差异则无统计学意义。
　透射电子显微镜观察结果 RelA siRNA组中细胞呈典型的凋亡征，即细胞表面微绒毛消失，胞膜出芽，胞质紧实，细胞器集中，核膜皱褶，染色质固缩、边集，呈新月形。可见凋亡小体，部分凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬。阴性对照组与空白对照组的细胞超微结构均相对正常(见图3)。
3 讨论
NF-κB作为一种快反应的核转录因子，在胰腺等组织细胞癌变的过程中起着重要作用，特别是 RelA(p65)亚基可反式激活很多基因，如血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)、黏附分子 (ICAM-1)、多药耐药基因(MDR)等，进而调节肿瘤细胞的增殖、凋亡抵抗、血管形成、侵袭转移和耐药等生物学行为。目前已经证实在不同种类的恶性肿瘤中，均存在NF-кB的持续激活，NF-кB的持续活化可作为多种实体肿瘤的标志。
本研究将化学合成的针对人NF-κB p65的小干扰RNA转染入胰腺癌细胞株PANC-1中，通过RT-PCR法、ELISA法检测siRNA的干扰效率。PCR结果示目标细胞中NF-κB p65 mRNA的表达受到明显抑制(，见图1)，表明所设计的siRNA起到了明显沉默目的基因表达的作用，即从mRNA水平上验证了siRNA的干扰效果。NF-κB通常存在于细胞浆，当其被激活后转移入细胞核内，与核DNA上的激素反应元件结合从而调控其下游基因的转录，实验组中p65亚单位的DNA结合活性的吸光度值降低(，见表1)，进一步说明siRNA有效抑制了NF-κB的活化，即从蛋白水平上验证了siRNA的干扰效果。其间使用ELISA法替代经典的凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)来检测p65亚单位的DNA结合活性具有更安全、便捷、灵敏的优点。
通过Hoechst33258核染色、流式细胞术、透射电子显微镜观察来说明NF-κB沉默后PANC-1细胞凋亡的改变，Hoechst33258核染色结果显示实验组的细胞核出现了比较典型的光镜下凋亡改变，即核染色变淡、核染色质边集现象。此外透射电镜观察发现实验组PANC-1细胞的超微结构也出现了明显的凋亡形态学变化，这进一步支持了核染色结论。两者结合对NF-κB沉默后胰腺癌细胞株凋亡水平增高进行了定性判断。
RNAi阻断NF-κB后使得抗凋亡蛋白survivin，bcl2表达降低，肿瘤细胞内半胱氨酸蛋白酶caspase3，7，9的活性增加，肿瘤细胞凋亡逃逸机制失调，对各种促凋亡因素的敏感性增加，进一步使得凋亡率增高。本次研究中，运用Annexin V/FITC法检测实验组的细胞凋亡率较对照组明显增加()，恰恰验证了这一观点，即对NF-κB沉默后胰腺癌细胞株凋亡水平增高进行了定量判断。这与形态学观察结果相呼应，间接反映了NF-κB在肿瘤细胞凋亡调控方面起到了一定作用。
RNA干扰现象作为生物在进化过程中一种保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，通过介导序列特异性的mRNA降解，从而产生相应的功能表型缺失，属于转录后基因沉默范畴。本次研究所使用的由美国Invitrogen公司化学合成的p65 stealthTM siRNA是一种经过特异性的化学修饰，长25 nt的干扰片段。这与传统标准化学合成的siRNA(22 nt)相比，半衰期长(持续10 d)，不易降解，而与构建表达载体相比又显得十分经济便捷。此外siRNA与反义脱氧寡核苷酸沉默目的基因相比，又具有稳定性高、抑制作用强、细胞摄取相对容易的优点，经证实满足本次实验研究的要求，达到了预期的实验目的。
基因治疗一直是肿瘤治疗研究的热点。本研究初步证明了NF-κB p65基因在胰腺癌细胞凋亡调控方面扮演重要角色，通过沉默其表达可诱导PANC-1细胞的凋亡，为进一步阐明NF-κB基因与胰腺癌的关系以及以NF-κB为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定了一定的理论基础。
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