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HPLC法测定噻康唑的含量和有关物质
【摘要】 目的 采用高效液相色谱法测定噻康唑的含量及有关物质。 方法　采用ODS C18色谱柱：Spherisob C18(×250mm，5μm)；保护柱(4mm×10cm)，以［甲醇∶乙腈(70∶30)］∶/L含有/L 1硫辛酸的磷酸三乙胺缓冲液(58∶42，V/V)为流动相(用磷酸调pH至)，流速/min，紫外检测波长260nm。结果 HPLC法测定的线性范围为～/ml，r=，最低检测限为20ng；样品溶液在24h内稳定，日内精密度和日间精密度良好(%)。回收率为%。结论 采用HPLC法测定噻康唑的含量及有关物质的方法简便，结果可靠。
【关键词】 噻康唑 有关物质 含量测定 HPLC
　　Determination of the content and the related substances of tioconazole by HPLC
ABSTRACT Objective To determine the content and the related substances of tioconazole by HPLC. Method　The　column:ODS C18 column (Spherisob C18 (×250mm, 5μm); protect column (4mm×10cm); the mobile phase: ［methanol∶acetonitrile (70∶30)］ triethyamine phosphate buffer (/L) containing 1octanesulphonic acid (/L) and adjusted to pH4 with phosphoric acid (58∶42, V/V); the flow rate: /min; the content of tioconazole and its related substances were detected at 260nm under the same condition. Results The liner detection range of the determination by HPLC is ～ mg/ml; the correlation coeffient is ; the detection limit is 20ng; the sample solution is stable within 24h; the intraday and interday precisions are both good (RSD1%). The recovery results are %. Conclusion The HPLC method is facile and accurate to determine the content and related substances of tioconazole.
KEY WORDS Tioconazole; Related substances; Content determination; HPLC
噻康唑(tioconazole)是Pfizer公司研制开发的抗真菌类药物。 文献 资料显示它对真菌感染有特效，具有广谱抗菌性［1］。该产品已被英国药典2000年版(BP2000)［2］及美国药典28版(USP28NF23)收载［3］。噻康唑中可能含有的杂质比较多，BP2002中列出了4种已知杂质：A、B、C、D，USP28NF23中列出了3种已知杂质A、B、C。BP2000测定噻康唑含量采用容量 分析 法，有关物质采用HPLC法；而USP28NF23则采用HPLC法测定其含量与有关物质。众多实验表明，①用USP28NF23及BP2000方法测定有关物质，杂质B与C的分离度较差；②用USP28NF23方法测定噻康唑含量时由于两杂质分离度不好也会造成含量测定不准确。本文 参考 了相关文献［4～6］，采用高效液相色谱法对其含量测定及有关物质的检查方法进行了系统 研究 。相对于USP及BP收载的标准，本方法根据噻康唑的紫外吸收，未采用USP的219nm，改用260nm，流动相也作了相应的调整。本方法的优势在于在有关物质检查及含量测定中能够有效地分离各组分，提高有关物质B、C分离的分离度，也提高了方法的准确性。
1 仪器与试药
PELC Series200高效液相色谱仪(Perkin Elmer)。噻康唑(批号：020202，020205，020220，本公司研制样品)， 噻康唑对照品(含量%， USP对照品)，杂质A、杂质B、杂质C和杂质D对照品(USP对照品)，甲醇、乙腈均为色谱纯。水为超纯水，由Milipore水纯化系统所制。
2 色谱条件
色谱柱：(Spherisob C18(×250mm，5μm)；保护柱(4mm×10cm)；流动相：［甲醇∶乙腈(70∶30)］∶/L含有/L 1硫辛酸的磷酸三乙胺缓冲液(58∶42，V/V)(用磷酸调pH至)；柱温40℃；流速/min；检测波长260nm；进样体积20μl。
3 测定方法
　含量测定
对照品溶液 取噻康唑对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释成每ml中含的溶液。
供试品溶液 取本品约100mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，混匀。取10ml此溶液置50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
　有关物质测定
对照品溶液 杂质A、B、C、D各取1mg精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇15ml，溶解后加至刻度。
供试品溶液 取本品100mg，置25ml容量瓶中，加15ml甲醇，振摇使溶解，再加甲醇至刻度。
4 结果与讨论
　方法的专属性
通过对噻康唑主产物、溶剂、合成中间体及降解产物进行HPLC分离检测，结果表明采用HPLC法测定噻康唑的含量及有关物质的方法专属性良好(1)。
采用USP28NF23该品种有关物质检查方法，杂质B、C分离度不佳，未达到相关要求(图2)。
　　系统适用性试验
取本品20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，制备成供试品溶液，进样20μl，记录色谱图， 计算 可得噻康唑的 理论 塔板数为2236，噻康唑峰与杂质分离度为。
　标准曲线的建立
精密称取噻康唑对照品100mg，置100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取、、、和分别置于50ml容量瓶中，用甲醇定容。取上述溶液在选定的色谱条件下，进样20μl，记录色谱图，根据峰面积计算，以3次测定的峰面积平均值做线性回归，得回归方程为
A=7×107C+193858 r=
表明在～/ml的范围内峰面积与测定浓度呈良好的线性关系。
　　　方法 的精密度
取浓度为/ml的噻康唑对照品溶液20μl注入液相色谱仪，连续进样5次，噻康唑峰面积的RSD为%(n=5)。取同一批供试品，配成6份溶液，分别进样 分析 ，含量测定结果的RSD为%(n=6)。
　方法的准确度
精密称取噻康唑对照品，按照浓度的80%、100%和120%配制供试品溶液，每个浓度配制3份，精密量取20μl注入液相色谱仪，以外标法 计算 加入量。平均回收率(RSD)分别为%(%)、%(%)和%(%)。
分别采用BP2000方法、USP28NF23方法与本文方法对3批供试品进行含量测定，同一批供试品的测定结果基本一致(表1)。
　溶液的稳定性
精密称取噻康唑对照品100mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，混匀，取10ml此溶液置50容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别于0、4、8、12、16和24h取20μl注入液相色谱仪，记录主峰面积，考察溶液的稳定性，结果平均峰面积为14784155，RSD=%。杂质含量与初始溶液浓度相比无明显变化，即对照品溶液在24h内稳定。表1 本方法与BP2000、USP28NF23方法测定结果比较
　有关物质最低检测限
在选定的色谱条件下，当灵敏度为时对最低检测限进行测定，结果表明，噻康唑的最低检测限为20ng。
　有关物质测定
分别采用BP2000方法、USP28NF23方法与本文方法对3批供试品进行有关物质测定，同一批供试品的测定结果基本一致，均小于%(表2)。
　测定波长的选择
取噻康唑适量，用甲醇溶解后，吸取适量流动相稀释，在190～400nm范围内扫描，虽然噻康唑的最大吸收峰在220nm处，但考虑到样品及有关物质检测灵敏度，及杂质B、C的吸收，选择260nm作为检测波长。
　溶剂的选择
噻康唑的溶解度试验表明，该样品极微溶于水，极易溶于甲醇，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，微溶于环己烷。参照BP2000及USP28，因此选择甲醇作为溶剂，同时流动相中也存在大量甲醇，进样时系统峰不会导致色谱峰变形。
　流动相的选择
噻康唑的已知杂质A、B、C、D为其降解产物或副产物，其与噻康唑的极性差别使得他们可以分离，考察了不同的流动相组成下杂质与溶剂峰、主药的分离情况。结合噻康唑及杂质的极性及溶解度情况，采用甲醇水、乙腈水、甲醇乙腈系统分别进行实验。试验结果表明乙腈甲醇水系统以不同比例的乙腈、甲醇、水为流动相分理效果可以，但杂质B、C分离度不佳。同时 参考 BP2002方法，采用缓冲盐做流动相，分离效果不甚理想。为了解决此 问题 考察了在流动相中调整缓冲盐的成分，经过试验选用/L含有/L 1硫辛酸的磷酸三乙胺缓冲液(用磷酸调pH至)，当［甲醇∶乙腈(70∶30)］∶缓冲液为58∶42时，噻康唑峰与4个杂质峰分离度≥，此时主峰的保留时间为12min左右。考虑到专属性要求及色谱柱填料的稳定，在缓冲液比例为42%时，流动相具有足够的缓冲容量，在线性测定中色谱峰形正常。
　保护柱的作用
在实验过程中考察了不同品牌的C18色谱柱，该方法耐用性较好，在各品牌的色谱柱上均有较好的柱效与分离度。增加保护柱的目的是使色谱柱的寿命延长，使所有破坏与污染都有所处理。经考察，不加保护柱也能够达到要求。表2 本文方法与BP2000及USP28方法的比较
【参考 文献 】
　　［1］ Bergan T, Vangdal M. In vitro activity of antifungal agents against yeast species ［J］. Chemotherapy,1983,29(2):104
　　［2］ British Pharmacopa Commission. British Pharmacopa 2002,Volume I ［S］. London:　The　Station Office,2000:1515
　　［3］ United States Pharmacopeial　［S］. Rockille: United States Pharmacopeial Convention,:1936
　　［4］ Wright A G, Fell A F, Berridge J C. Development and optimisation of a highperformance liquid chromatographic assay for tioconazole and its potential impurities. I. Selection of separation conditions ［J］. J Chromatogr,1989,464(1):27
　　［5］ Wright A G, Berridge J C, Fell A F. Development and optimisation of a highperformance liquid chromatographic assay for tioconazole and its potential impurities. Part II. Selection of detection conditions for potential impurities ［J］. Analyst,1989,114(1):53
　　［6］ Di Pietra A M, Cavrini V, Andrisano V, et al. HPLC analysis of imidazole antimycotic drugs in pharmaceutical formulations ［J］. Pharm Biomed Anal,1992,10(10～12):873