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嗅黏膜嗅鞘细胞的实验研究概述

　　【关键词】 嗅鞘细胞
嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells ,OECs) 在功能上是介于施万细胞和少突胶质细胞之间的一种特殊的胶质细胞 ,具有神经营养、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等， 为轴突生长提供了适宜的微环境及较强的迁移的特性，使其成为促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。嗅鞘细胞同胶质细胞、施万细胞在表现型上有共同点，它们都能促进轴突的再生，主要区别在于嗅鞘细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于外周神经中。
嗅黏膜中的神经元是唯一的生后才生长并在成年时继续分化的神经元，寿为 4～12 周，随着新细胞的生长，又建立了新的神经支配关系。嗅鞘细胞存在于嗅神经及嗅球的神经层上，沿嗅神经的全长，从周围神经系统到中枢神经分布。
成年哺乳类嗅黏膜中的嗅觉神经元具有终生更新的特点,由此说明嗅黏膜中存在神经干细胞。
嗅黏膜由源于外胚层的嗅板及位于其底部的间充质发育、分化而来,由上皮和固有层组成。上皮内的嗅细胞是初级嗅觉神经元,成体嗅黏膜内的嗅细胞终生处于不断凋亡、更新之中,新生嗅细胞的轴突进入固有层由嗅鞘细胞包绕形成嗅神经,经筛孔进入嗅球与僧帽细胞形成突触,在轴突的生长和突触的重建过程中,嗅鞘细胞具有重要的诱导作用［1～3］。
　　1 嗅鞘细胞的研究现状
嗅鞘细胞从被发现到体外培养成功,再到能够用于动物实验研究及应用于临床研究,经历了漫长的时间。Devon和Doucete［4］于1992年首次证实嗅鞘细胞可在体外培养条件下形成髓鞘。嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤是近10年发展起来的。Li等［5］报道嗅鞘细胞移植到受损的成年大鼠皮质脊髓束可以促进轴突再生,脊髓功能得以改善。2000年Barnet［6］首次报道用术中切除的嗅球在体外培养并扩增人类嗅鞘细胞,并证明这些细胞生理功能良好,植入啮齿动物脱髓鞘区域能髓鞘化轴突,且无致瘤性。近年从嗅黏膜中提取、纯化培养嗅鞘细胞，以其独特优势和临床应用价值，越来越受到重视。
　　2 嗅鞘细胞的实验取材方法
成年SD大鼠体重250～300g,腹腔麻醉后,消毒面部皮肤。经一侧鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨,暴露鼻中隔黏膜,用虹膜枪和眼科剪分离、剪取鼻中隔后三分之一嗅黏膜。可见鼻中隔最后上部的嗅区,呈黄色与呼吸道黏膜有较明显的区别。将此嗅区鼻中隔(嗅黏膜和骨质)完整取下,在显微镜下将两侧的嗅黏膜自骨片上完整刮下,立即放入冰的DMEM抗生素液中(青霉素和链霉素各100IU/L)。有学者从后鼻孔和直接开颅进入鼻中隔，分离嗅黏膜。
　　3 嗅黏膜细胞的体外培养
嗅黏膜取出后用F12培养基漂洗3次去除血迹后移至%胰酶中,用眼科剪充分剪碎并用吸管吹打,制成嗅黏膜混合细胞悬液,用培养基终止消化,离心、清洗去除胰酶，用含10%胎牛血清的F12培养基将细胞浓度调至1×106/ml,接种于无包被的玻璃培养皿,置CO2培养箱内(37℃,5%CO2)培养。每2～3天换液一次。
当将离体嗅黏膜制成细胞悬液后,细胞之间的平衡即被打破,接触抑制及反馈调节机制亦被解除。细胞悬液中的神经干细胞在其他细胞分泌的细胞因子和细胞外基质的作用下,将进入细胞分裂、增殖周期。
整个培养过程,更换培养液也十分关键。嗅黏膜OECs贴壁生长时间较晚,一般在培养第5～6天才开始,不像嗅球OECs 24h后就大量贴壁生长。所以在这段时间内换液应十分小心,尽量不要晃动培养液,以保持细胞沉淀,根据情况最好行1/3量换液或根据培养液的颜色添加培养液,以免丢失细胞。
纯化：按改良Nash差速贴壁法在培养36～48h后,将培养液吸出,重新种植于包被多聚右旋赖氨酸的24孔细胞培养板内,进行纯化培养。纯化培养液中可加入20μmol/L的Forskolin和20μg/ml的BPE(bovine pituitary extract)以促进细胞的生长培养14天,其间观察细胞生长情况,间或摄片。成纤维细胞的生长可机械刮除亦可用5μmol/LAra c处理24h来控制。Ara c对OECS的生长也有抑制作用，故有学者也不主张使用。
是否纯化的观点：有部分学者认为根据嗅黏膜细胞的社会学特性,即各种细胞之间存在着相互依存、相互诱导、相互制约的调节机制。嗅黏膜神经干细胞和嗅鞘细胞体外培养时,不宜过早地纯化细胞,混合细胞培养更有利于各细胞成分的分裂、增殖尤其是有利于神经干细胞克隆球的形成。Shou等［7］将嗅上皮细胞与其基底细胞共培养发现,后者能促进神经前体细胞的增生,其实验结果从另一侧面证明了上述观点 。
　　4 嗅黏膜细胞的免疫细胞化学染色
目前常用的染色方法主要有：Nestin染色、NSE染色、GFAP及p75NGFR染色等，体外培养的时间不同，免疫反应阳性细胞形态亦不相同，成熟的嗅鞘细胞大多为梭形双极细胞,突起细长,其走向具有明显的方向性,细胞排列成束。
　　5 原代培养嗅黏膜细胞的生长特点
嗅黏膜细胞接种于培养皿24h内除少数球形细胞悬浮外,大部分细胞已贴壁,贴壁细胞多呈扁平多边形,单层片状生长。此后可见散在的球形细胞粘附于扁平细胞表面并分裂增殖,逐渐形成克隆球。于培养早期可见少数克隆球首先悬浮生长,几天后贴壁生长并逐渐分化。克隆球于1周内生长较快,随着球体增大其生长逐渐变慢,2周后直径至1mm左右,球体不再生长,自克隆球周边有球形细胞向外迁移,迁移出的细胞大多最终分化成梭形的嗅鞘样细胞,细胞排列方向性较为一致;少数分化成嗅细胞样细胞,胞体为卵圆形具有两根突起。突起一根细长,多贴附于梭形细胞上,另一根较粗短,顶端隐约可见嗅毛。形态多为双极或三级。
改良差速贴壁法细胞生长特点：一般细胞培养7～8天后,增殖最快,数量明显增多,细胞成分以梭形(双极)和多突起的大细胞为主,常呈成团生长,但联系松散,生长缺少方向性。据报道［8］这些梭形和双极细胞主要是OECs和嗅神经元,有部分窝形细胞属上皮细胞,大细胞可能是未分化的神经胶质细胞。培养至14天以后的细胞,形态没有大的变化,主要为双极和梭形细胞,但数量往往开始减少，杂细胞占优势。Forskolin和BPE的应用可以大大促进细胞的生长。杂细胞主要是成纤维细胞,也有明显生长,需应用Ara c进行纯化，或者采用机械刮除。改良差速贴壁法，培养至14天的OECs免疫组化染色结果表明,大部分双极或梭形细胞呈GFAP或p75NGFR免疫反应阳性。
　　6 同其他干细胞的比较
干细胞移植治疗中枢神经系统疾病已经有了较大进展,但是目前还存在一些问题有待解决:神经干细胞的分化取决于神经营养和生长因子、细胞因子、细胞外基质分子、细胞黏附分子、细胞- 细胞接触和神经变性等的作用。干细胞有可能使受损的脑组织建立神经连接,但原发和继发的损伤事件如中性粒细胞和巨噬细胞侵入、神经元和胶质细胞死亡将影响移植的干细胞的分化;虽然干细胞具有低免疫原性的特点,但仍存在异体移植排斥;不管是在体外培养条件下还是体内环境下神经干细胞都会有很大一部分分化成星形胶质细胞,形成星形胶质的瘢痕,使干细胞分裂、分化和迁移、并形成有功能的正常神经元网络是非常困难的。
骨髓间质干细胞是具有多分化潜能的细胞,可分化为间质组织,在特定的条件下可分化为神经细胞、肝细胞、心肌细胞等非来源组织的细胞,具有类似胚胎细胞的多能性［9～11］,且取材方便,因而作为组织工程“种子细胞”有广泛的应用前景［12～15］，自体移植可以避免排斥反应，但诱导分化有一定困难。
脐血干细胞也是一种具有多向分化潜能的原始干细胞，但存在异体移植的伦理道德，及诱导分化的技术困难问题。
嗅黏膜嗅鞘细胞移植具有以下的优点：移植物来源方便、损伤小，通过活检方法即能获得所需的移植物，且并不影响嗅觉，(2)避免了异体移植所带来的技术与道德问题。但是其纯化培养的方法尚不成熟，需要进一步研究。
嗅黏膜嗅鞘细胞以其独特的优势成为细胞移植领域研究的一个热点，是一种具有临床应用价值的、十分具有潜力的移植物。但其培养纯化技术仍不十分成熟，需要相关研究人员共同努力，使之更加完善，以造福
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