p16INK4A和bcl.docx

p16INK4A和bcl2蛋白在CIN和宫颈鳞癌中的表达
【摘要】 目的 探讨p16INK4A和bcl2在宫颈上皮内瘤(CIN)和宫颈鳞癌的表达状态及其在病理诊断中的意义。 方法　采用免疫组化SP法对39例CIN、24例浸润性宫颈鳞癌和20例正常宫颈进行p16INK4A和bcl2检测。结果 正常宫颈组织不表达p16INK4A，CINⅠ阳性表达率很低并为局灶表达，但几乎所有的CINⅡ/Ⅲ和浸润性宫颈鳞癌均弥漫大量表达p16INK4A。正常宫颈组织只有基底细胞层表达bcl2蛋白，CINⅢ和Ⅰ～Ⅱ期浸润癌bcl2阳性细胞弥漫分布，阳性表达率分别为%和%。Ⅲ～Ⅳ 期浸润癌bcl2阳性率下降，阳性细胞局限。结论 p16INK4A过表达与宫颈鳞癌恶性特性密切相关，检测p16INK4A有助于及时发现高级别CIN和宫颈鳞癌。
【关键词】 p16INK4A蛋白；bcl2蛋白；宫颈鳞癌；宫颈上皮内瘤
　　The　Expression and Value of p16INK4A and bcl2 in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Squamous Carcinoma
　　Abstract：Objective To study the expression and value of p16INK4A and bcl2 in CIN and cervical squamous　39 cases of CIN, 24 cervical invasive squamous carcinoma and 20 normal cervical tissues were stained for p16INK4A and bcl2 by immunohistochemistry method. Results p16INK4A immunoreactivity was absent in all normal cervical tissues, its positive rate in CINⅠ was very low too, but p16INK4A expressed almost in all of CIN Ⅱ/Ⅲ and invasive carcinoma. Bcl2 immunoreactivity in normal cervical tissues was only seen in cells of basal layer. Its positive rate in CIN Ⅲ and Ⅰ～Ⅱ stage invasive carcinoma were %% respectively,　which　positive cells were diffuse and its staining intensity was higher than in normal cervical tissues. Its positive rate in Ⅲ～Ⅳ stage invasive carcinoma was striking decreased, which positive cells were focal. Conclusion p16INK4A over expression may be seen as a marker of CIN Ⅱ/Ⅲ and invasive carcinoma which is useful in pathological diagnosis.
　　Key words：p16INK4A protn；bcl2 protn；Cervical squamous carcinoma; CIN
　　0 引言
　　绝大多数宫颈鳞癌由宫颈上皮内瘤　而来，及时、正确诊断和 治疗 CIN，特别是CINⅡ/Ⅲ，是降低宫颈鳞癌发病率和死亡率的有效措施。对高级别CIN和典型的宫颈鳞癌不难做出正确的病理诊断，但如何准确鉴别CINⅠ和CINⅡ却存在着一定的困难，鳞状上皮化生与高级别CIN从形态上也有一定的相似性，有时也容易出现误判。因此，寻求特异性分子标记物是客观、准确诊断CIN所必需。 研究 表明p16INK4A特异性地表达于高级别CIN和宫颈鳞癌，并能间接地抑制bcl2表达，从而诱导宫颈癌的发生 [13]。本研究对正常宫颈、各级CIN和浸润性鳞癌组织进行了p16INK4A和bcl2免疫组化染色，以探讨p16INK4A和bcl2在宫颈鳞状上皮的表达状态及其意义。
　　1 材料和方法
　　材料
　　收集三峡大学第二临床院病理科近10年宫颈手术或活检标本83例，其中，正常宫颈20例，CIN39例，浸润性宫颈鳞癌24例。术前均未进行针对肿瘤的特殊治疗。福尔马林固定，石蜡包埋，病理医师确诊。浸润性宫颈鳞癌按1995年FIGO标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。
　　试剂与方法
　　采用免疫组化SP法，即用型鼠抗人p16INK4A单抗、鼠抗人bcl2单抗及免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。用已知染色阳性的宫颈组织切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。操作步骤严格按照试剂盒说明进行，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。
　　结果判断

　　p16INK4A定位于细胞质和细胞核，bcl2定位于细胞质，以光镜下出现棕黄色颗粒为阳性染色。结合阳性细胞数目和分布范围进行结果判定。p16INK4A判定标准为：观察5个高倍视野，阳性细胞数少于观察细胞总数的10%为阴性表达；超过观察细胞总数的10%但局限于上皮下1/3层为阳性表达；超过观察细胞总数的10%并分布范围超过上皮下1/3层为强阳性表达。bcl2判定标准为：观察5个高倍视野，阳性细胞数少于观察细胞总数的10%为阴性表达；超过观察细胞总数的10%为阳性表达。学处理采用χ2检验。
　　2 结果
p16INK4A在正常宫颈鳞状上皮不表达，13例CINⅠ仅有2例局灶表达，所有的CIN Ⅱ/Ⅲ均表达p16INK4A，24例浸润癌仅1例无p16INK4A表达。CINⅢ和浸润癌阳性细胞均呈弥漫分布。
正常宫颈鳞状上皮基底细胞层都表达bcl2，而基底细胞层以外的鳞状上皮都不表达bcl2。CINⅠ/Ⅱ bcl2仍只表达于基底细胞层。CINⅢ和Ⅰ～Ⅱ期浸润癌bcl2阳性表达率高而阳性细胞弥漫分布。Ⅲ～Ⅳ 期浸润癌bcl2阳性表达率下降而阳性细胞局灶分布，见表1。表1 宫颈组织p16INK4A和bcl2表达与临床病理因素的关系
　　3 讨论
在 科技 迅猛发展的今天，病理诊断仍然是疾病诊断的金标准，发挥着指导治疗和判断预后的作用。但是，病理诊断在很大程度上依赖于病理医生的阅片。因此，经常出现病理医生之间诊断意见不一致的现象。虽然病理医生对CIN和宫颈鳞癌的组织学特征很熟悉，但病理诊断的不一致率仍然很高。Klaes等 发现CINⅡ病理诊断一致率仅为35%，非典型增生以外的宫颈病变病理诊断一致率仅为3%。可见，为了准确对宫颈组织切片和细胞涂片进行病理诊断，病理者必须寻找有效而客观的诊断指标。

　　肿瘤抑制基因p16INK4A编码蛋白是细胞周期素依赖激酶4抑制剂，与细胞周期蛋白D1竞争性地结合于CDK4，抑制细胞增殖。多种肿瘤的发生与p16INK4A突变、丢失或甲基化有关，但宫颈非典型增生和宫颈鳞癌却以p16INK4A过表达为特征。Klaes等　研究 结果表明几乎100%的高级别CIN和浸润癌都表现为p16INK4A免疫组化染色强阳性，而其他的宫颈鳞状上皮则不能检测到p16INK4A，即p16INK4A免疫组化染色有助于在切片上分辨出非典型增生的细胞和癌细胞。Murphy等 也发现p16INK4A特异性表达于CINⅢ和宫颈浸润癌的胞质。Kalof等 研究证明p16INK4A免疫组化染色强度与CIN程度相关，虽然CINⅠ也可呈现 p16INK4A阳性结果，但2/3层以上上皮弥漫阳性着色的结果几乎全部出现在CINⅡ/Ⅲ病例。本研究也取得了相似的结果，正常鳞状上皮不表达p16INK4A，而CINⅡ/Ⅲ和浸润性鳞癌几乎都表达p16INK4A，并且阳性细胞均为弥漫分布。说明p16INK4A异常过表达特异性地出现在高级别CIN和浸润性宫颈鳞癌。因此，用免疫组化 方法 检测p16INK4A表达状态有助于诊断高级别CIN和宫颈鳞癌，特别有助于辨认微小CIN病灶及早期浸润癌，使CIN和宫颈鳞癌的病理诊断更加客观，避免对高级别CIN和微小浸润癌的漏诊，避免将良性宫颈病变误诊为宫颈鳞癌。在上对怀疑有CIN或宫颈鳞癌者进行p16INK4A免疫组化检测有助于及时诊断高级别CIN和宫颈鳞癌病人，以免延误 治疗 。
　　p16INK4A表达状态不仅与CIN程度呈正相关，与高危型人乳头瘤病毒感染也呈正相关。Kalof等 发现100%CINⅡ/Ⅲ都可检测到与宿主DNA整合的HRHPV信号，而CINⅠ其整合率仅为%，HRHPV整合信号阳性的CIN组织p16INK4A染色强度显着增高。Murphy等 也证实p16INK4A表达强度与HRHPV感染密切相关。Guimaraes等 对65例低级别CIN进行研究，发现进展到高级别CIN者，p16INK4A过表达，并与HPV16/18检出之间显着相关，而维持于低级别CIN者p16INK4A表达状态与HPV16/18检出之间并无此相关性，说明HPV16/18感染可导致宿主细胞高表达p16INK4A，并使病变进一步演进。关于HRHPV感染促使p16INK4A高表达的机制，可能是HRHPV序列整合到宿主细胞DNA，导致病毒E7蛋白过表达，而过表达的E7蛋白可削弱抑癌基因Rb功能，使细胞周期失调，并促进p16INK4A过表达 。
　　bcl2蛋白为凋亡抑制基因bcl2表达产物，可抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生。不同的恶性肿瘤，其表达状态不同。 文献 报道宫颈鳞癌bcl2阳性表达率从17% ～54% 不等。多数研究 [710]表明CINⅢbcl2阳性表达率明显高于CINⅠ/Ⅱ和浸润癌，而正常宫颈鳞状上皮阳性细胞仅限于基底细胞层 [9，11]。本研究结果显示正常宫颈和CIN Ⅰ/Ⅱbcl2阳性表达均限于基底细胞层，而CINⅢbcl2阳性细胞范围扩大，基本与非典型增生范围一致，阳性表达率高达%，即bcl2在CINⅢ的表达状态与CIN Ⅰ/Ⅱ有显着性差异。5例Ⅰ期浸润性鳞癌有4例表达bcl2，阳性细胞弥漫分布，而Ⅲ～Ⅳ 期浸润癌bcl2阳性表达率降至%且癌细胞局灶阳性。可见，bcl2表达状态对筛选高级别CIN有一定的 参考 价值，但诊断浸润性鳞癌时，其参考价值不大。bcl2表达于正常鳞状上皮基底层，可能与基底细胞分裂增生活跃有关。CINⅢ和Ⅰ期浸润性鳞癌bcl2阳性细胞增多，阳性程度增强，导致恶性细胞抗凋亡能力增强，增大了病变进一步　的可能性。
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