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枫香槲寄生抗肿瘤有效部位总皂苷的提取及含量测定研究
【摘要】 　　目的探讨枫香槲寄生抗肿瘤有效部位总皂苷的提取工艺条件及含量测定方法。方法采用正交实验法设计提取条件，以齐墩果酸为对照品，用紫外分光光度法测定总皂苷的含量，优化提取方案。结果回收率为 % ，RSD＝% 。各因素对总皂苷提取的影响程度依次为：乙醇浓度提取次数提取时间乙醇倍量。结论提取的最佳工艺条件为5倍量60％乙醇回流提取两次， h/次 ，该方法稳定，准确，重现性好。
【关键词】 枫香槲寄生 紫外可见分光光度法 正交实验 总皂苷
　　Abstract:ObjectiveTo establish the methods to extract and determine the antitumor saponins from Viscum liquidambaricolum　optimized condition for extraction was determined by orthogonal design. UV-Spectrophotometry was used for the determination. ResultsThe recovery ratio was %, RSD=%. The order of factors to affect the total saponins extraction was ethanol concentration　solvent quality　extraction time　extraction　optimum extraction conditions are 5 times 60% ethanol reflux 2 times, hour per time. The methods are stable ,accurate and reliable.
　　Key words:Viscum liquidambaricolum Hayata； Ultraviolet-visible spectrophotometry； Orthogonal test; Total saponins
　　枫香槲寄生Viscum liquidambaricolum Hayata.系桑寄生科槲寄生属植物，该属植物主要分布于台湾及南方的一些省区，寄生于枫香、油桐、柿树或壳斗科等多种植物上。本植物草药名“枫树寄生”，有祛风除湿、舒筋活络之功效［1］。全株入药，治风湿性关节疼痛、腰肌劳损,民间以寄生于枫香树上为佳［2］。据报道枫香槲寄生中含有三萜［3］，黄酮苷［4］。我们的前期研究从枫香槲寄生中获得2个色原酮化合物［5］、反式桂皮酸、齐墩果酸、白杨素、圣草酚以及新化合物枫香槲寄生苷 ［6］、芫花素、β-香树脂醇乙酸酯、古柯二醇等［7］。其中三萜及三萜皂苷类化合物是抗肿瘤的有效成分［7］，主要集中于正丁醇部位。目前萜类化合物研究为天然产物化学中最活跃的部分，从中发现了许多结构复杂的新化合物，其中不少显示多种生物活性 ［8］。基于此，为进一步深入研究该植物的化学成分及生物活性，本研究采用正交实验法，对影响枫香槲寄生醇提正丁醇萃取部位总皂苷提取效果的诸因素进行考察,选择最佳提取条件，运用比色法以齐墩果酸为对照品，对枫香槲寄生中正丁醇萃取部位总皂苷的含量进行了测定。
　　1 仪器与材料1 仪器
　　日本岛津UV-2201型紫外光谱仪测定；德国sartorius电子天平；恒温水浴锅(型号：HHS11-4S)。2 材料
　　齐墩果酸对照品；枫香槲寄生植物购于广州清平药材市场并经广东药学院罗集鹏教授鉴定为枫香槲寄生Viscum liquidambaricolum Hayata；乙醇，正丁醇，甲醇，香兰素，浓硫酸均为分析纯，水为去离子水。
　　2 方法与结果
　　对照品溶液的制备
　　将齐墩果酸对照品干燥至恒重，精密称取对照品 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，吸取1 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，配成浓度为 mg/ml的对照品溶液，摇匀备用。
　　齐墩果酸对照品的显色方法
　　精密吸取1 ml 浓度 mg/ml 的对照品溶液于小试管中，水浴挥干溶剂，依次加入新配制的8%香兰素－乙醇溶液 ml，72%硫酸5 ml，摇匀，置90℃ 水浴加热10 min，立即取出，置冰水浴中冷却15 min。显色剂同法操作作为空白对照［9］。
　　测定波长的选择
　　取齐墩果酸供试品溶液于400～700 nm内扫描，在540 nm 处有最大吸收，确定540 nm为测定波长，测得的结果以齐墩果酸为基准计算总皂苷的含量。
　　标准曲线的绘制精密吸取
　　,,,,,, ml齐墩果酸对照品溶液于具塞试管中，水浴中挥干溶剂。按“”显色条件显色。于540 nm测定吸光度值。得回归方程：结果表明，在60～150 μg 范围内, 齐墩果酸显色后的吸光度值与加样量的线性关系良好。回归方程为A= 9C+ 9，相关系数r= 3(N=6)。见图1。
　　稳定性实验精密吸取
　　齐墩果酸对照品溶液 ml于具塞试管中，沸水浴上挥干溶剂。按显色条件显色。记时测定，每隔20 min 测定吸光度值，共测120 min。RSD=%。结果表明齐墩果酸在120 min内显色稳定。结果见表1。表1 稳定性考察结果
　　精密度实验精密吸取
　　齐墩果酸对照品溶液，，，，，， ml,于具塞试管中，于沸水浴上挥干溶剂。按显色条件显色，冷却至室温后测定吸光度值。RSD＝%，结果表明，精密度良好。
　　供试品溶液的制备
　　枫香槲寄生药材的提取条件考察将枫香槲寄生药材粉碎，过筛，精密称取药材粗粉约2 g于250 ml 圆底烧瓶中，用乙醇回流提取，选择：乙醇浓度，乙醇倍量，提取时间和提取次数4个因素，每个因素3个水平,按L9正交表实验。见表2。表2 L9因素水平
　　样品的预处理
　　精密称取2 g 药材于250 ml 圆底烧瓶中，按正交实验表设计提取条件进行提取，得到的提取液过滤后，于水浴上挥干溶剂，残渣以水溶，水溶液用50 ml 正丁醇萃取4次，合并正丁醇层，用循环水泵减压蒸干溶剂，得到的残渣用甲醇溶解，定容于50 ml 容量瓶中,所得溶液待测。
　　不同提取条件的供试品含量测定
　　精密吸取定容后各供试品溶液置具塞试管中，水浴挥干溶剂，按“”项下操作方法显色供测试用，同时以随行溶剂作空白，计算枫香槲寄生总皂苷百分含量。结果见表3。
　　正交设计实验结果
　　方差分析按方差分析理论得方差分析结果。表4表明乙醇浓度有显着性差异。乙醇用量、提取时间、提取次数无显着性差异。最佳提取条件为A1B2C3D2。实验结果见表3～4 。表3 正交实验结果表4 方差分析
　　重复性实验
　　取同一产地药材6份按正交实验设计表第1号实验提取，按显色条件显色，测定吸光度。计算药材中的总皂苷含量。重复进行5次，RSD= %。结果见表5。结果表明该方法重现性良好。表5 重现性考察结果
　　回收率实验精密
　　称取约2 g同一批次药材5份，按“”项下方法预处理样品，按表6所示量分别加入齐墩果酸对照品溶液，按“”项下显色条件显色，测定吸光度。表6 回收率实验
　　样品的含量测定
　　按正交实验所得出的最佳提取条件分别进行2004和2005年两批次样品的总皂苷含量测定。按“”项下操作方法显色，在540 nm处测定吸光度。两批总皂苷的平均含量分别为％，%。
　　3 讨论
　　在前期枫香槲寄生的研究中，分离鉴定到齐墩果酸，所以选用齐墩果酸为对照品，测定枫香槲寄生正丁醇部位中总皂苷的含量。
　　在总皂苷测定实验中，以齐墩果酸为标准对照品，紫外扫描最大波长在540 nm，样品显色的线性范围在60～150 μg,显色后100 min内显色稳定，精密度实验的RSD＝%，说明了总皂苷含量测定采用紫外分光光度法具有准确，灵敏，稳定的特点。
　　在考察的各个因素中，A因素为乙醇浓度，B因素为乙醇用量，C因素为提取时间，D因素为提取次数。对得到的实验数据进行方差分析，由极差R分析得知A因素即乙醇浓度对提取效果影响具有显着性意义，因素C，D对结果也有一定影响，其影响因素依此为 A　D　C　B 。方差分析最佳提取方案为A1B2C3D2。
　　在预实验中，采用醇回流提取法提取枫香槲寄生的总皂苷，醇提液挥干溶剂后水溶解，水溶液分别用石油醚，醋酸乙酯，正丁醇萃取，检测到在正丁醇部位皂苷含量最高，且具有抗肿瘤细胞活性，故实验中采用正丁醇萃取部位进行含量测定研究，为今后的化学成分及生物活性研究提出新的思路。
　　对枫香槲寄生的正丁醇部位总皂苷含量的测定表明，总皂苷的含量较高，2005年采摘药材的皂苷含量略高于2004年采摘药材皂苷含量。表明枫香槲寄生正丁醇部位皂苷化合物的性质较稳定，有进一步研究的价值。
【参考文献】
　　［1］中国科学院华南植物研究所.广东植物志［M］.广州：广东科技出版社，1987:227.
　　［2］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1988:156.
　　［3］Chen CS, Chen SZ. Phytochemical studies on Viscum liquidambaricolum［J］.Taiwan yaoxue Zazhi ,1973,25(1-2):55.
　　［4］Liu KC, Lee SS. Flavanoid glucgsides isolated from Viscum liquidambaricolum［J］.Zhonghua Yaoxue Zazhi,1993,45(3):231.
　　［5］杨燕军.枫香槲寄生化学成分的研究［J］.中药材, 1998，21：22.
　　［6］杨燕军，林洁红，许雄伟.枫香槲寄生化学成分的分离与结构鉴定［J］.药学学报，2005，40(4):351.
　　［7］杨燕军，陈慧云，林洁红，等.枫香槲寄生化学成分及抗肿瘤活性的研究(Ⅲ)［J］.广州中医药大学学报，2007，24：163.
　　［8］于德泉，吴毓林.天然产物化学进展［M］.北京：化学工业出版社，2005：86.
　　［9］郭明全，宋凤瑞，陈貌连，等.超声提取分光光度法测定刺五加中总皂苷含量［J］.分析化学，2002,30(2)：250.