化妆品中α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚的检测方法（征求意见稿）及起草说明.pdf

1化妆品中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的检测方法（征求意见稿）1 范围范围本方法规定了高效液相色谱法测定化妆品中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的含量。本方法适用于水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类、面膜类、粉类化妆品中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚含量的测定。2 方法提要方法提要样品经甲醇超声提取后，采用高效液相色谱系统分离，荧光检测器检测，根据保留时间定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。如有阳性结果，应用液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法进行确证。本方法中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的检出限、定量下限及取样量为1.0g时检出浓度和最低定量浓度见表1。表1-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的检出限、检出浓度、定量下限和最低定量浓度组分检出限（ng）定量下限（ng）检出浓度（g/g）最低定量浓度（g/g）-熊果苷12.525-熊果苷12.525氢醌0.050.150.10.3苯酚0.10.30.20.63 试剂和材料试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。3.1 甲醇，色谱纯。3.2 微孔滤膜（0.45 m）。3.3-熊果苷、-熊果苷、氢醌、苯酚4种标准物质。3.4 标准储备溶液分别称取-熊果苷标准物质、-熊果苷标准物质、氢醌标准物质和苯酚标准物质（3.3）各10 mg（精确到0.0001 g），置不同10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度分别为1 mg/mL的标准储备溶液。24 仪器和设备仪器和设备4.1 高效液相色谱仪，荧光检测器。4.2 天平。4.3 高速离心机（转速14000 rpm）。4.4 超声波清洗器。4.5 涡旋振荡器。5 分析步骤分析步骤5.1 混合标准溶液的制备分别准确量取-熊果苷标准储备溶液（3.4）1 mL、-熊果苷标准储备溶液（3.4）1 mL、氢醌标准储备溶液（3.4）0.1 mL和苯酚标准储备溶液（3.4）0.2 mL，置同一个10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）定容至刻度，配制成-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚浓度分别为100 g/mL、100 g/mL、10 g/mL和20 g/mL的混合标准溶液。5.2 混合标准系列溶液的制备准确量取不同体积的混合标准溶液（5.1），用甲醇（3.1）配制成浓度如表2所示的混合标准系列溶液。表2 储备溶液浓度及混合标准系列浓度组分-熊果苷-熊果苷氢醌苯酚储备液，g/mL1000100010001000混合标准溶液，g/mL1001001020混合标准系列溶液，g/mL0.250.250.0250.050.50.50.050.1110.10.2220.20.4880.81.62020245.3 样品处理称取样品1.0 g（精确到0.001 g），置10 mL具塞比色管中，加入甲醇至10 mL，在涡旋混匀器上高速振荡30 s，使样品与提取溶剂充分混匀。密塞，超声提取20 min，静置至室温，3取适量样品溶液离心（转速14000 rpm）5 min，取上清液经微孔滤膜（3.2）过滤，取续滤液作为待测溶液。必要时用适量甲醇稀释。5.4 参考色谱条件色谱柱：C18柱（250 mm4.6 mm5 m）；流动相：A：水；B：甲醇；柱温：20；流速：0.5 mL/min进样量：5 L；检测波长见表3；流动相梯度洗脱程序见表4。运行完后平衡10分钟。表3-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的检测波长组分激发波长（nm）发射波长（nm）-熊果苷292337-熊果苷292337氢醌298345苯酚280318表4 流动相梯度洗脱程序时间/minV（流动相A）/%V（流动相B）/%095521.095522.0554543.0505048.0505048.1010050.001005.5 测定在“5.4”色谱条件下，取混合标准系列溶液（5.2）分别进样，进行色谱分析，以标准系4列溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。取“5.3”项下的待测溶液进样，根据保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的浓度。按“6”计算样品中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的含量。必要时按附录A方法进行定性确证。6 分析结果的表述分析结果的表述6.1 计算mVD式中：-样品中待测组分的质量分数，g/g；-从标准曲线得到待测组分的浓度，g/mL；V-样品定容体积，mL；m-样品取样量，g；D-稀释倍数（如未稀释则为1）。在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6.2 回收率和精密度回收率为85%115%，相对标准偏差小于10%（n=6）。7 图谱图谱图1 标准溶液的液相色谱图1：-熊果苷（19.567 min）；2：-熊果苷（20.920 min）；3：氢醌（30.685 min）；4：苯酚（42.472 min）。5附录A（规范性附录）-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚结果的确证1.-熊果苷和熊果苷和-熊果苷熊果苷的的液相色谱液相色谱-串联质谱法串联质谱法确证确证1.1试剂和材料1.1.1微孔滤膜（0.22 m）。1.2 仪器和设备1.2.1 液相色谱-串联质谱联用仪，带电喷雾离子源（ESI源）。1.2.2高速离心机（转速12000 rpm）。1.3样品处理取正文“5.3样品处理”项下待测溶液，加适量水稀释后，离心（转速4000 rpm）5 min，取上清液，用微孔滤膜（1.1.1）过滤，取续滤液作为待测溶液。1.4参考色谱条件色谱柱：C18柱（100 mm4.6 mm 2.7m），或等效色谱柱；柱温：20；进样量：2 L；流动相：A：水，B：甲醇。梯度洗脱程序见表A-1。表A-1-熊果苷、-熊果苷梯度洗脱程序时间/min流速/mL/minV（流动相A）/%V（流动相B）/%00.395510.00.395512.00.359515.00.359515.10.395520.00.39551.5参考质谱条件离子源：ESI源；监测模式：负离子多反应监测模式，监测离子对及相关电压参数设定见表A-2；6离子源喷雾电压：-4500 V；气帘气压力：25 psi；雾化气压力：45psi；辅助气压力：20 psi；离子源温度：450。表A-2 质谱监测离子对及相关电压参数设定表待测物母离子（m/z）去簇电压(V)子离子（m/z）CE（V）-熊果苷271.0-65151.0-18271.0-65108.0-30-熊果苷271.0-65161.0-12271.0-65108.0-241.6定性判定用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定，在相同试验条件下，样品中应呈现两个监测离子的色谱峰，样品中各离子的保留时间应与相应标准溶液中各离子的保留时间一致；样品色谱图中所选择的监测离子的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表 A-3 规定范围，则可以判断样品中存在相应待测物。表 A-3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（k）k50%50%k 20%20%k 10%k 10%允许的最大偏差20%25%30%50%1.7图谱图A-1-熊果苷、-熊果苷标准溶液的液相色谱-串联质谱MRM图1：-熊果苷（6.731 min）；2：-熊果苷（7.088 min）。72.氢醌的氢醌的液相色谱液相色谱-串联质谱法串联质谱法确证确证2.1 试剂和材料2.1.1甲醇（色谱纯）。2.1.2 维生素C（分析纯）。2.1.3 氯化钠（分析纯）。2.1.4 固相萃取小柱（60 mg/3 mL），吸附剂为含吡咯烷酮基的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。2.1.5 微孔滤膜（0.22 m）。2.1.6 进样小瓶内衬管。2.1.7 15%甲醇溶液：量取甲醇（2.1.1）15 mL，用水稀释至100 mL。2.1.8 维生素C溶液：取维生素C（2.1.2）适量，用水溶解并配成浓度为100 mg/mL的溶液。2.2 仪器和设备2.2.1 液相色谱-串联质谱联用仪，带电喷雾离子源（ESI源）。2.2.2 旋转蒸发仪。2.2.3高速离心机（转速12000 rpm）。2.3 样品处理称取样品1.0 g，准确加入15%甲醇溶液（2.1.7）10 mL、维生素C溶液（2.1.8）0.2 mL，涡旋振荡1 min，再加入氯化钠（2.1.3）2 g，涡旋振荡1 min，离心（转速12000 rpm）15 min，取5 mL上清液，待净化。取固相萃取小柱（2.1.4），依次预先用3 mL甲醇（2.1.1）、10 mL水进行活化。将待净化液倒入小柱中，自然流尽后，用10 mL水清洗小柱，待清洗液自然流尽后，加甲醇（2.1.1）6 mL洗脱，收集洗脱液于尖底烧瓶中，用旋转蒸发仪（水浴温度35）减压浓缩至近干，加甲醇（2.1.1）0.2 mL，涡旋振荡30 s，用微孔滤膜（2.1.5）过滤至内衬管中（2.1.6），作为待测溶液。2.4参考色谱条件色谱柱：C18柱（100 mm4.6 mm 2.7 m），或等效色谱柱；柱温：20；进样量：5 L；流动相：A：水，B：甲醇。氢醌的梯度洗脱程序见表A-4。8表A-4 氢醌梯度洗脱程序时间/min流速/mL/minV（流动相A）/%V（流动相B）/%00.290105.00.2901010.00.2752515.00.2722816.00.2208020.00.2208020.10.2901026.00.290102.5参考质谱条件离子源：ESI源；监测模式：负离子多反应监测模式，监测离子对及相关电压参数设定见表A-5；离子源喷雾电压：-4500 V；气帘气压力：25 psi；雾化气压力：45psi；辅助气压力：20 psi；离子源温度：450。表A-5 质谱监测离子对及相关电压参数设定表待测物母离子（m/z）去簇电压(V)子离子（m/z）CE（V）氢醌109.0-5981.0-17109.0-5953.0-182.6 定性判定用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定，在相同试验条件下，样品中应呈现两个监测离子的色谱峰，样品中各离子的保留时间应与相应标准溶液中各离子的保留时间一致；样品色谱图中所选择的监测离子的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表 A-6 规定范围，则可以判断样品中存在相应待测物。9表 A-6定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（k）k50%50%k 20%20%k 10%k 10%允许的最大偏差20%25%30%50%2.7 图谱图A-2 氢醌标准溶液的液相色谱-串联质谱MRM图1：氢醌（12.280 min）。3.苯酚的苯酚的气相色谱气相色谱-串联质谱法串联质谱法确证确证3.1 仪器：气相色谱-串联质谱联用仪，带电子轰击离子源（EI源）。3.2 样品处理取正文“5.3 样品处理”项下待测溶液直接进行测定。3.3 参考气相色谱-质谱条件色谱柱：聚乙二醇键合交联固定相毛细管柱（30 m0.25 mm0.25 m），或等效色谱柱；柱温：120/min保持1 min，以20/min程序升温至220，保持4 min；进样口温度：230；载气流速：1.5 mL/min；分流比：1:1;溶剂延迟：2.5 min;进样量：1 L；离子源：EI源；离子源温度：200；传输线温度：230；电离能量：70 eV；扫描方式：多反应离子监测，监测离子对及相关电压参数设定见表A-7；10表A-7 质谱监测离子对及相关电压参数设定表待测物母离子（m/z）子离子（m/z）CE（eV）苯酚94.066.0994.055.0153.4定性判定用气相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定，在相同试验条件下，样品中应呈现两个监测离子的色谱峰，样品中各离子的保留时间应与标准溶液中各离子的保留时间一致；样品色谱图中所选择的监测离子的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表 A-8 规定范围，则可以判断样品中存在相应待测物。表 A-8定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（k）k50%50%k 20%20%k 10%k 10%允许的最大偏差20%25%30%50%3.5图谱1：苯酚（4.815 min）。图A-3 苯酚标准溶液的气相色谱-串联质谱MRM图11附录B（资料性附录）-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚4种标准物质基本信息表表 B-1 标准物质基本信息表中文名称英文名称CAS 登录号分子式-熊果苷-arbutin84380-01-8C12H16O7-熊果苷-arbutin497-76-7C12H16O7氢醌hydroquinone123-31-9C6H6O2苯酚phenol108-95-2C6H6O12化妆品中化妆品中-熊果苷、熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的检测方法熊果苷、氢醌和苯酚的检测方法起草说明起草说明为加强化妆品监督管理，进一步提高化妆品产品安全性，受国家药品监督管理局委托，中国食品药品检定研究院组织开展了“化妆品中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的检测方法”的建立和验证工作。现就起草工作有关情况说明如下：一、起草必要性-熊果苷、-熊果苷为差向异构体，是美白化妆品中常见的美白成分。目前相关检验标准仅为化妆品中熊果苷的检测方法（SN/T 1475-2004），该标准中的检测方法不能区别-熊果苷、-熊果苷。实际检验发现，化妆品标签中熊果苷的标注存在不规范的地方，有的仅标注熊果苷，有的标注为-熊果苷、-熊果苷。由于-熊果苷、-熊果苷的价格差异较大，故标签的不规范伤害了广大消费者的利益。另外，据文献报道，-熊果苷、-熊果苷在一定的条件下（例如强酸、强碱、高温）可降解产生毒性较强的氢醌。氢醌和苯酚具有美白效果，但因毒性较强，是化妆品的禁用组分。化妆品安全技术规范（2015 年版）中规定了氢醌、苯酚的检测方法，检出限分别为 7 g/g、2 g/g，欧盟消费者安全科学委员会（SCCS)认为含-熊果苷的化妆品中氢醌的含量应小于 1 g/g。因此化妆品安全技术规范（2015 年版）中氢醌的检测灵敏度不能满足检测需求，有必要进行修订。二、起草原则本方法修订时，尽量采用目前化妆品实验室普遍具有的先进分析技术，以便于方法的推广、执行。方法兼具先进性与可行性，条理清晰，操作性强，选择准确、可行、便于实际操作的分析条件，保证了检测方法的可操作性和重现性。三、起草过程通过查阅国内外文献，结合以往工作经验和研究基础，于 2017 年开展了本方法的起草研究，在 2018 年建立了化妆品中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的检测方法。2018 年 9月向三家验证单位寄送了本方法的验证技术资料、验证用标准品和样品，于 2018 年 10 月、12 月陆续收到验证报告，并对验证报告进行了总结和分析，进一步完善了检测方法。2019年 5 月中国食品药品检定研究院组织召开了专家评审论证会，会后根据专家意见对本方法进行了修改完善，形成征求意见稿。13四、重点问题的说明（一）关于体例。本检测方法的体例主要参照化妆品安全技术规范（2015 年版）的理化检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。（二）关于检测方法的建立和验证。本课题以选用高效液相色谱进行研究，经 3 家单位验证，方法满足化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范相关技术要求，适用于不同基质化妆品中-熊果苷、-熊果苷、氢醌和苯酚的定性定量测定。（三）考虑到方法的灵敏度、实际样品的干扰情况、样品的阳性情况，采用液相色谱-串联四极杆质谱联用法进行-熊果苷、-熊果苷、氢醌的确证；采用气相色谱-串联四极杆质谱联用法进行苯酚的确证。五、起草依据及文献1化妆品安全技术规范（2015 年版）2化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范（国食药监许2010455 号）3SN/T 1475-2004化妆品中熊果苷的检测方法4房军，杨艳伟，张伟，等.化妆品中-熊果苷稳定性研究J.卫生研究，2009,38(2):214-215.5秦良，刘有停，陈毅明，等.基础环境因素对-熊果苷和-熊果苷稳定性的影响J.日用化学工业，2014,44(10):580 583.6SCCS,Gisela H.Opinion of the scientific committee on consumer safety(SCCS)-opinion onthe safety of the use of-arbutin in cosmetic products J.Regulatory Toxicology andPharmacology,2016,(74):75-76.7SCCS,Gisela H.Opinion of the scientific committee on consumer safety(SCCS)-opinion onthe safety of the use of-arbutin in cosmetic products J.Regulatory Toxicology andPharmacology,2015,(73):866-867.