小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良.docx

小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
【摘要】 目的 建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法 改良酶消化法。结果 用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。结论 与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得 小鼠 动脉血管平滑肌细胞 原代培养
Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.
Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult
在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法，从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
1 材料与试剂
1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。
1．2 试剂： 鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。
1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％ 胎牛血清、１％青霉素、 链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用。
1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)， 过滤除菌即用。
1．5 ７０％乙醇：用无菌蒸馏水配制。
1．6 器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜，荧光显微镜(LEICA DMI6000B）。
2 方法
2．1 常规麻醉小鼠，70％乙醇冲洗颈部和腹部, 打开胸、腹腔 , 暴露心脏。
2．2 ５ mL 注射器穿刺左心室， PBS 缓冲液冲洗主动脉。
2．3 完整分离主动脉，放入100 mm无菌平皿，滴1～2滴PBS 缓冲液。
2．4 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明。
2．5 取出血管，放入另一有 PBS 缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。
2．6 眼科剪将血管快速剪成１～２ mm2 大小后用胶原酶消化３～４ h。
2．7 加入 DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1 ml 新鲜培养基重悬细胞，接种于１２孔培养板中的一孔，常规静置培养。
2．8 第2天观察是否有细菌污染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。于第５、６天细胞生长达培养皿面积的８０％左右时可传代，常规方法即可。
　　3 细胞鉴定
免疫荧光法鉴定平滑肌细胞：常规消化，细胞接种于培养载玻片。第2天用PBS 缓冲液轻缓洗涤，加％福尔马林液在室温下固定30 min后用PBS 缓冲液洗涤３次，２ min／次。然后用 ％ Triton-x-100 (PBS配制) 室温下渗透细胞10 min，以便抗体更好的进入细胞。用10％山羊血清(PBS配制) 封闭非特异性抗原30 min，鼠抗SMC-α-actin 室温下孵育细胞２ h，PBS 缓冲液洗涤３次，５ min／次。以下步骤避光：用荧光标记二抗在室温下孵育细胞１ h，PBS 缓冲液洗涤３次，５ min／次，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测。
4 结果
细胞于第2天游离出，第3天沿细胞团成放射状生长，成梭形，传代后细胞生长较快， 成典型的峰谷样生长， 细胞形态多呈宽大的长梭形， 核大一只小鼠的主动脉用该法培养，１０天左右即可获得１０6个细胞，传代生长快，可满足任何细胞试验要求。流式细胞仪检测细胞纯度达98%以上，免疫荧光检测显示细胞 SMC-α-actin 染色呈阳性， 绿色荧光呈束状，显示肌丝特征。
5 讨论
传统的原代培养方法［１,２］有两种， 一种是酶消化法，将组织用合适的酶消化后培养，因除去了妨碍细胞生长的间质，所以产量高，但因步骤繁琐，易发生污染且材料消耗较多，只适合培养大块组织。另一种是组织块培养法， 将组织活体取出后剪切成小块，贴于瓶壁等待细胞从组织四周游离出，该法细胞生长较慢且不一定每块都长出细胞，所以成功率不高, 但适合组织量少的细胞培养。目前国内平滑肌细胞的原代培养多采用组织块贴壁法［３～６］，因而也存在上述弊端。如何简化操作、提高细胞培养的成功率？在试验中我们反复比较，发现在传统的酶消化方法上进行改良可获得很好的效果，从而建立了上述改良的血管平滑肌细胞原代培养技术。该方法将以往复杂的酶消化过程简化，大大减少了组织损失及污染机会，并简化了血管分离技术，使操作容易掌握，可重复性强，并且所培养的细胞活力强、生长快。在试验过程中，我们发现如注意以下几点可大大提高培养成功率：第一，要强调无菌观念，所用器械要高压消毒，打开胸、腹腔时所用的剪刀和镊子不再重复使用 ，其他器械在使用中要不断浸到70%乙醇中消毒灭菌，这样做基本可避免污染。第二，选用鼠龄８ W以上完全成年的小鼠。第三 ，使用解剖显微镜去除外膜，由于视野放大更能完整干净的去掉血管外膜。第四，小鼠动脉细小而薄，内膜无须刮除 。第五，掌握好消化时间，如果用新鲜的胶原酶，消化３ h或略长即可，太长的时间可致细胞活力丧失。第六，在最初两天尽可能不要动细胞，以免干扰细胞贴壁。
【参考文献】
［1］ 司徒镇强.细胞培养［M］. 第二版 .北京:世界图书出版社 ，2007
［2］ 卢圣栋.现代分子生物学实验技术 ［M］. 第二版 .北京:中国协和医科大学出版社,1999. 439-441
［3］ 王敏,崔连群.动脉血管平滑肌细胞、血管内皮细胞原代培养的改良及应用［J］.山东医药，2004,44(14) ：17-18
［4］ 冯大明,万载阳.组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞［J］.南华大学学报,2003,31(3): 251-253
［5］陈焰炫、刘健康.动脉平滑肌细胞原代培养贴块法的改良［J］.生物学杂志，2002,19(4)：27-28
［6］敏、李江华等，表达人载脂蛋白AI小鼠主动脉平滑肌细胞的培养及意义［J］.基础医学与临床, 2000,20(1) :38-40