慢性苯中毒患者外周血TCR-Vδ亚家族T细胞分布和克隆性研究.docx

慢性苯中毒患者外周血TCR Vδ亚家族T细胞分布和克隆性研究
【摘要】 　　目的: 了解慢性苯中毒患者外周血T细胞的TCRVδ基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法: 利用RTPCR方法扩增10例慢性苯中毒患者外周血单个核细胞中8个TCR Vδ基因的互补决定区3(CDR3), PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果: 8例健康人平均表达个Vδ亚家族, 外周血中未检测到Vδ4和Vδ5亚家族, 慢性苯中毒患者工人表达个Vδ亚家族, 外周血中未检测到Vδ1、 Vδ3、 Vδ4和Vδ8亚家族, 与健康人比较有显着性差异。6例慢性苯中毒患者存在1～2个Vδα亚家族T细胞出现克隆性增殖。结论: 慢性苯中毒患者外周血出现TCR Vδ亚家族倾斜性分布和克隆性增殖T细胞, 这可能是苯中毒后所引起的机体特异性免疫反应。
【关键词】 苯 TCR Vδ基因 克隆性T细胞
　　苯是目前应用最为广泛的化工原料和工业溶剂之一。有关慢性苯中毒以及接苯所致再生障碍性贫血, 骨髓增生异常综合征和白血病确切发病机制仍不明确［1］。多项研究已表明苯及其代谢物抑制T细胞的增殖而损伤机体细胞免疫功能, 人外周血T细胞主要表达TCRαβ+T细胞, 我们前期工作发现苯接触人群和苯中毒患者的外周血TCRVα, Vβ亚家族T细胞表达和克隆模式发生改变［2, 3］, 提示苯对T细胞免疫可能存在的损伤。尽管外周血中仅存在少量的TCRγδ+T细胞, 但对机体细胞免疫功能同样举足轻重。通过分析慢性苯中毒患者外周血T细胞中TCRVδ基因各亚家族细胞的分布和克隆性增殖情况可以更为全面地了解慢性苯中毒患者 T 细胞的免疫功能变化。
　　1 材料和方法
　　材料 慢性苯中毒患者外周血标本10例, 其中男4例、 女6例, 年龄20～48岁, 平均年龄岁, 工龄～年, 平均(±)年; 健康人外周血标本8例, 其中男5例、 女3例, 年龄24～40岁, 平均年龄岁, 慢性苯中毒患者标本由广州市第十二人民医院提供, 健康人外周血标本来源于本试验室工作人员。慢性苯中毒患者均有职业接苯史, 慢性苯中毒患者和健康人均无影响造血和免疫功能的基础疾患、 首次就诊3个月内未使用影响造血和免疫功能的药物、 无癌症史、 放疗及化疗史、 无其他骨髓毒性化学物接触史和放射线接触史。10例慢性苯中毒患者中含5例慢性轻度苯中毒、 5例慢性重度苯中毒。
　　方法
　　RNA提取和cDNA合成 RNA提取应用TRIzol试剂盒并应用随机引物和反转录酶试剂盒反转录合成cDNA 第1链, 均按常规方法进行。
　　引物设计 根据TCRδ的8个亚家族分别设计8个Vδ引物作为上游引物作为上游引物并在Cδ区设计一下游引物Cδ, 另外在Cδ的引物上游再设计一荧光素标记的Cδfam引物作为标记PCR产物和基因扫描之用。引物均由德国柏林 TIB MOLBIOL公司合成［4］。
　　表1 用于 TCR Vδ 基因检测的引物序列
　　PCR扩增PCR 按已报道的方法进行［5］。总反应体积为20 μL, 其中含1 μL cDNA、 任一Vδ引物和Cδ引物、　mmol/L dNTP、 1 U Taq聚合酶、　mmol/L Mgcl2和10×PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪中进行, 共进行40循环, 每一循环包括: 94℃ 1 min, 60℃ 1 min 和72℃ 1 min, PCR 产物保存于4℃中备用。
　　T细胞克隆性分析 10 μL 的反应体系含 2 μL 的未标记的PCR产物、　μmol/L Cδfam 引物、　mmol/L MgCl2,　mmol/L dNTP, 1 U Taq聚合酶和PCR缓冲液。PCR共进行35循环, 退火温度为66℃, 余同上。取2 μL荧光素Fam标记的PCR产物加入高质量的去离子甲酰胺与标准品(Perkin Elmer GENESCANTM500LIZTM, ABI, 其中含有荧光素LIZ标记的不同大小的DNA片段)按20∶1比例配好的10 μL混合液, 94℃变性4 min, 然后将样品加入96孔板, 直接装载到已灌好POP4胶的3100 DNA序列分析仪上进行电泳, 电泳所采集结果经基因扫描分析软件分析产物的长度和荧光强度。
　　统计学分析 采用统计软件进行相关统计分析。
　　2 结果
　　TCR Vδ亚家族T细胞的表达情况 8例健康人经8个 Vδ亚家族的PCR 扩增后, 分别可检测到6～7个Vδ亚家族阳性产物, 平均表达±个 Vδ亚家族, 10例慢性苯中毒患者分别可检测到1～2个Vδ亚家族阳性产物, 平均表达 ±个 Vδ亚家族, 与健康人相比明显减少。8例健康人除Vδ4和Vδ5亚家族未检测到外, 表达的 Vδ 亚家族比较集中Vδ1、 Vδ2和Vδ3。10例慢性苯中毒患者样本中仅检测到11个Vδ亚家族的RTPCR产物, Vδ1、 Vδ3、 Vδ4和Vδ8亚家族均未检测到。轻度慢性苯中毒患者和重度慢性苯中毒患者之间Vδ亚家族表达率无明显差异。
　　图1 TCR Vδ各亚家族在健康人和慢性苯中毒患者外周血的表达情况
　　T细胞克隆性分析结果 基因扫描分析结果显示, 8例健康人外周血中在不同亚家族中出现克隆性T细胞, 主要集中在Vδ1、 Vδ2和Vδ3, 9/10例慢性苯中毒患者中分别有1～2个Vδ亚家族多克隆模式发生了改变, 扫描分析呈现双克隆、 寡克隆增殖的图象。出现克隆性增殖改变的Vδ亚家族分布在不同个体中, 慢性苯中毒工人比较集中的趋势见于Vδ2亚家族。
　　3 讨论

　　TCRVδ基因包含可变区、 多样区、 结合区和恒定区。人类TCR δ基因位于14号染色体长臂上, 由8个Vδ、 2个Dδ、 3个Jδ和一个Cδ基因片段组成。在TCRVδ重排过程中由于选用不同的J区以及在各基因片段连接的过程中, 有不同数量的核苷酸随机插入, 称为N区。因此在V区与D区、 D区与J区的连接处, 均有不同数量核苷酸的N区, 形成了一个VNDNJ序列的高变区, 称之为CDR3区。CDR3是识别抗原的区域, 不同克隆所形成的CDR3的长度和碱基序列不相同。特异性抗原刺激可使TCR Vδ基因谱出现倾向性分布和克隆性增殖, 并预示着相应的功能改变。目前有关TCR Vδ基因表达变化在自身免疫系统疾病, 血液系统肿瘤和一些实体瘤中的报道较多［6, 7］, 但尚未见慢性苯中毒患者TCRVδ基因亚家族变化的相关报道。

　　应用RTPCR基因扫描方法分析TCR Vδ 8个亚家族的CDR3长度是近年国外新形成的研究方法。本研究中8例健康人经8个Vδ亚家族的PCR扩增后, 分别可检测到6～7个Vδ 亚家族阳性产物, 未检测到Vδ4和Vδ5亚家族。9例慢性苯中毒患者可检测到1～2个Vδ 亚家族阳性产物, Vδ1、 Vδ3、 Vδ4和Vδ7亚家族均未检测到, 慢性苯中毒患者检出的亚家族的数量较健康人检出亚家族数明显减少。与TCR Vβ亚家族全部表达于正常人外周血T细胞的情况不同, TCR Vδ亚家族在正常人外周血T细胞中的出现频率不同, 部分亚家族也未能在外周血中检测到, 而出现频率较高的是Vδ1和Vδ2家族, 本研究结果与既往文献报道相似。但在慢性苯中毒患者外周血中, TCR Vδ1亚家族T细胞未能检测到, 这种倾斜性分布可能与机体接苯后某些Vδ亚家族表达受限, 也可能是机体接苯后对相关抗原的一种直接反应从而引起机体中一些Vδ亚家族的增殖而抑制了另外一些Vδ亚家族表达, 本研究所发现TCR Vδ亚家族表达情况, 具体是何种原因引起值得探讨。

　　在8例健康人外周血中检测到在不同Vδ亚家族中出现克隆性T细胞, Shen等［8］在分析正常人外周血T细胞TCRVδ1和Vδ2表达中也有类似的报道, 并认为在正常人外周血中所出现的这种克隆性是TCRVδ T细胞的一种普遍特征。10例慢性苯中毒患者外周血中在检测到的Vδ亚家族中有3个亚家族发生克隆性改变, 并且比较集中在Vδ2亚家族, 尽管在8例健康人中也检测到Vδ2亚家族发生克隆性改变, 但二者之间发生克隆性改变的Vδ2亚家族中选用的J区以及CDR3区是否相同仍需下一步通过对CDR3区序列进行分析才能明确。TCRγδ T可以通过MHC非限制性方式识别多种抗原, γδ T细胞所识别的抗原谱与αβT细胞有明显不同, 从而与αβT细胞在功能上具有互补性［9］。慢性苯中毒患者Vδ5和Vδ7亚家族的克隆性改变在健康人中未发现, 尤其是在健康人中未检测到Vδ5亚家族表达。本研究中慢性苯中毒患者Vδ5和Vδ7亚家族的克隆性增殖有可能与机体接苯后对相关抗原的的一种特异反应相关。

　　总之, 本研究结果首先提供了慢性苯中毒患者外周血中TCRVδ亚家族T细胞表达和克隆模式变化的情况, 为机体接苯后T细胞免疫功能改变补充了新资料, 有关TCRVδ亚家族T细胞分布和克隆性改变的发生机制有待进一步研究。
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