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β内酰胺类抗生素导致药源性溶血的初步研究
【摘要】 本研究的目的是初步探讨β内酰胺类药物诱导患者溶血性贫血的机理。 对2004年6例肺部感染且不明原因贫血分析的患者的基础疾病、治疗用药、感染病原体等信息进行归纳，对患者外周血进行白细胞计数、网织红细胞计数、总胆红素、直接胆红素、血糖检测，对患者的红细胞进行直接抗人球蛋白试验(DAT)、补体结合实验、细胞培养与涂片镜检，对患者血浆中的抗体进行间接抗人球蛋白试验(IAT)。结果发现:6例患者的临床治疗的药物都属于β内酰胺类；住院期间患者的WBC、TB、DB、Glu的检测结果出现异常，红细胞的DAT试验结果均为阳性，IAT试验结果均为阴性；将DAT阳性的红细胞进行补体结合实验时，结果为阴性；细胞涂片见部分红细胞表面有颗粒状物质附着，细胞培养见部分红细胞被白细胞识别、黏附；改用其它抗生素后，患者的上述化验指标恢复到正常值范围内，DAT试验结果转为阴性。结论:β内酰胺类抗生素引起患者溶血性贫血的原因可能是某些蛋白在红细胞表面的非特异性吸附，这些物质很可能是导致患者出现药物性溶血的直接原因。
【关键词】 药源性溶血
　　Effect of β-lactam Antibiotics in Drug-induced Hemolysis
　　Abstract The study was purposed to evaluate synergistic effect of β-lactam antibiotics in drug-induced hemolysis. The general information，including primary diseases，therapeutic drugs，infection pathogens in 6 patients with pulmouary infection and unknown reason anemia were integrated and analyzed. The leukocyte and reticulocyte counts，total bilirubin (TB)，direct bilirubin (DB)，fasting blood glucose (Glu in peripherat blood) were all determined by conventional method. At the same time，the erythrocyte direct antiglobulin test (DAT)，complement fixation test (CFT)，cell culture and smear examination were carried out. The antibodies in plasma were also detected by indirect antiglobulin test (IAT). The result showed that levels of WBC，TB，DB，Glu and reticulocyte in six patients treated with β-lactam antibiotics were raised remarkably. DAT was strongly positive，but no RBC antibodies were detected in the plasma by IAT. The binding of red cells by monocytes or lymphocytes was great，and the hemolysis of red cells by alexin not appeared. After stopping above-mentioned β-lactam antibiotic administration，patient’s WBC，TB，DB，and Glu levels returned to normal values. Furthermore，DAT test result turned to negative. It is concluded that β-lactam antibiotics lead to drug-induced hemolysis by non -specific adsorption of some proteins onto RBC surface，and their proteins may be considered as direct cause for this hemolysis.
　　Key words drug-induced hemolysis; β-lactam antibiotic; direct globulin test
　　临床上有很多疾病如慢性肝炎、肝癌、系统性红斑狼疮和慢性阻塞性肺疾病可能导致溶血性贫血。有些疾病导致患者红细胞溶血的原因已经基本清楚，如SLE等自身免疫性疾病能产生大量自身抗体，导致自身免疫性溶血性贫血。但大多数疾病导致的贫血，其机理尚不十分清楚。我们将患者的临床诊治经过和实验室检查结果结合起来，对其基础疾病、病程发展、用药情况等资料进行归纳，对患者红细胞的形态、生物学活性及血清抗体含量等检测数据进行分析，希望通过具体数据的归纳总结，探讨患者贫血的原因。
　　材料与方法
　　研究对象
　　2004年肺部感染且不明原因贫血的患者6例。患者入院诊断分别是原发性肝癌1例、 胆总管结石伴慢性胰腺炎1例、肺纤维化1例、肺部感染1例、肾功不全2例。
　　主要试剂
　　聚凝胺试剂盒购自台湾东耀生物技术有限公司；Liss Coombs反应卡(含广谱抗人球蛋白血清)购自DiaMed公司；RPMI 1640培养液为Gibco公司产品；白细胞过滤联袋，规格为RF-Ⅱ-200。
　　方法
　　病史采集
　　对不明原因的贫血患者进行病史采集，包括患者性别、年龄、血型、大量输血史、感染史、用药情况等信息。
血样的各项化验检测 对患者外周血白细胞、网织红细胞、总胆红素、直接胆红素、血糖进行检测，并详细记录检测结果。
　　血样的直接和间接抗球蛋白试验
　　多次留取患者血液标本，利用DiaMed ID反应卡进行红细胞的DAT测定和患者血浆与抗体筛查细胞的间接抗人球蛋白试验(IAT)，操作按DiaMed ID说明书。对红细胞压积进行56℃热放散试验，放散试验按《输血技术手册》操作［1］，提取放散液与抗体筛查细胞进行IAT。
　　红细胞补体结合实验
　　补体来自当日健康献血员标本中的血清。将患者的红细胞2 ml洗涤后与献血者的同型血清2 ml混合，置37℃水育箱内，每10分钟显微镜下观察一次红细胞状态。自身对照管内为患者的红细胞和血清，阳性对照瓶内含RH阳性红细胞、IgG类抗-D抗体和献血者血清。
　　血细胞形态学检测
　　将患者和健康人当日采集的全血稀释后，用相差显微镜观察红细胞的活体状态。将患者的红细胞与同型健康人的白细胞各5 ml经洗涤后混合，以含20%小牛血清的1640培养液对混合细胞行100倍稀释，置细胞瓶内37℃孵育培养4小时，并将混合细胞涂片、瑞氏染色，显微镜下拍照记录结果。采用健康人的红细胞与同型人的白细胞混合做阴性对照。
　　过滤后红细胞检测
　　将与白细胞孵育后的红细胞用100 ml生理盐水稀释，再用白细胞过滤联袋滤除其中的白细胞，对过滤后的红细胞进行直接抗人球蛋白试验(IAT)和配血试验，记录试验结果。
　　结 果
　　患者的基本信息
　　患者的基本信息见表1。 Table 1. General information about six patients with hemolytic anemia
　　从表中可以看出6位患者感染的病原微生物不同，但对临床治疗的抗生素药物进行分析，都属于一类-β内酰胺类。其中马斯平(maxipime)的主要成分是头孢吡圬，凯舒特(kaishute)为头孢哌酮钠和他唑巴坦钠的混合制剂，美罗培南(merrem Ⅳ）为头孢菌素，特治新(bezhixin)为哌拉西林钠和他唑巴坦钠的混合制剂，舒普深(sulparazon)为头孢哌酮钠和舒巴坦钠的混合制剂。Table 2. Test results of six hemolytic anemia patients treated with antibiotics for one week
　　患者的各项化验指标结果
　　患者在使用抗生素药物治疗感染1周后出现贫血时的检测结果见表2。从表中可以看出，当患者出现溶血性贫血时，其WBC、TB、DB、Glu和网织红细胞计数的检测结果绝大部分出现异常。患者出院前WBC、TB、DB、Glu的化验结果已恢复到正常范围。
　　抗球蛋白试验结果
　　将6例患者的红细胞经洗涤和56℃热放散，红细胞的DAT试验结果均为阳性，表现为++—+++；对患者的血浆和红细胞放散液行IAT试验，结果均为阴性。患者停用抗生素后，对其血样检测DAT、IAT，结果均为阴性。
　　补体结合实验结果
　　6例患者的红细胞与当天献血员的血清混合后，37℃水育30分钟后未见溶血。阳性对照管内见溶血。
　　细胞的形态学检测结果
　　在相差显微镜下观察6例患者的红细胞的活体状态，发现部分红细胞表面有颗粒状物质附着。将红细胞与大量同型白细胞混合培养3小时后，吸取少量混合细胞进行涂片、瑞氏染色，普通显微镜观察。结果在显微镜下可见部分红细胞附着在白细胞的表面和周围。显微镜下拍摄的1名B型患者用药后的红细胞状态见图1，图2。
从图1中可以看出，健康献血者的血样中红细胞细胞分布均匀，透光度一致，细胞表面光滑；使用舒普深治疗1周的患者血样中部分红细胞表面有颗粒状物质附着，且红细胞的透光度不均匀。
图2显示，细胞混合3小时后，健康人的红细胞与同型献血者的白细胞分散排列于视野，未出现黏附、吞噬现象；患者的红细胞有些分散排列于视野，但部分表面有颗粒状物质附着的红细胞和透光度不均匀的红细胞易粘附在白细胞的周围，形成红细胞与白细胞的聚合体。
　　过滤后的红细胞检测
　　患者的红细胞经过与白细胞混合培养、过滤后，采用DAT试验进行检测，4例结果阴性，2例结果为±。
　　讨论
　　针对6例患者不明原因的贫血，我们对患者当时的血样进行了TB、DB、WBC、Glu、网织红细胞计数检测，发现这些检测指标均有所增高，红细胞的DAT试验结果均阳性，参照国内外对溶血性贫血的检测项目，初步可以确定6例患者为溶血性贫血。
很多疾病诸如SLE、慢性肝炎、COPD、肿瘤等均可出现溶血性贫血［2］。究其机理，除反复大量输血的原因外，自身免疫性抗体、疟疾等病原体的侵入、治疗用药等因素都有可能导致溶血性贫血。我们对6例患者的输血史、感染源、用药种类均进行了记录，发现6例患者无大量输血史，感染的病原微生物均不相同，但所用的抗生素均含有β内酰胺类。患者在停用该类抗生素后，患者红细胞的DAT检测结果转为阴性，总胆红素和直接胆红素量恢复正常。因此高度怀疑该6例患者是因抗生素治疗引起的溶血性贫血。根据国外对抗生素引起的溶血性贫血的类似报道，引起溶血性贫血的药物主要是β类酰胺类药物［3］，其中包括β内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠［4］、克拉维酸等［5］，以及头孢类抗生素头孢菌素［6］、头孢替坦等［6］。
目前，一些研究者认为自身抗体或者某些蛋白复合物黏附在红细胞膜的CR1受体上，是造成DAT阳性和患者产生溶血性贫血的原因［7］。本研究中的6例患者，红细胞DAT试验阳性，但血浆、红细胞放散液的IAT均为阴性，红细胞的补体结合实验也未见溶血，我们考虑溶血与某些蛋白复合物有关，与自身免疫性抗体无关。因为针对红细胞的自身免疫性抗体不仅存在于红细胞膜上，也存在于患者的血浆中，DAT、IAT应表现为均阳性，而且自身免疫性抗体与红细胞结合后，加入补体会导致溶血。此外，从红细胞的涂片镜检结果中，可以看出部分红细胞表面不光滑，而且这些红细胞起能够被同型人的白细胞识别，被白细胞识别的红细胞能用白细胞过滤联袋滤除，而未与白细胞起反应的红细胞DAT结果阴性，这可能与某些蛋白非特异性吸附在红细胞表面有关。1986年Jamin［8］就提出了非免疫性物质能吸附在红细胞的表面。国外对抗生素引起的溶血性贫血的病例报道中，这些蛋白不仅能非特异性吸附于红细胞表面，而且还能诱导单核细胞识别并破坏红细胞［9］。
【参考文献】
　　1肖星甫. 输血技术手册. 成都：四川科学技术出版社. 1992: 503-505
　　2Dhaliwal G，Cornett PA，Tierney LM，et al. Hemolytic anemia. Am Fam Physician，2004; 69: 2599-2606
　　3Garratty G，Arndt PA. Positive direct antiglobulin tests and haemolytic anaemia following therapy with beta-lactamase inhibitor containing drugs may be associated with non-immunologic adsorption of protein onto red cells. Br J Haematol，1998; 100: 777-783
　　4Broadberry RE，Farren TW，Bevin SV，et al. Tazobactam-induced haemolytic anaemia，possibly caused by non-immunological adsorption of IgG onto patient′s red cells. Transfus Med，2004; 14: 53-57
　　5Williams ME，Thomas D，Harman CP，et al. Positive direct antiglobulin tests due to clavulanic acid. Antimicrob Agents Chemo- ther， 1985; 27: 125-127
　　6Garratty G，Leger R. Red cell membrane proteins (CD55 and CD58) are modified following treatment of RBCs with cephalosporins. Blood，1995； 86：68-70
　　7郭峰. 现代红细胞免疫学. 上海：第二军医大学出版社，2002: 68-70
　　8Jamin D，Demers J，Shulman I，et al. An explanation for nonimmunologic adsorption of protein onto red blood cells: Schiff′s base reactions. Blood，1986； 67: 993-996
　　9Arndt P，Garratty G. Can non-specific protein coating of RBCs lead to increased RBC destruction? Drug-treated RBCs with positive antiglobulin tests due to non-specific protein uptake give positive monocyte monolayer assays. Transfusion，2000； 40: 29-31