刘冬版种子的扩大培养.pptx

l掌握工业发酵种子扩大培养的工艺过掌握工业发酵种子扩大培养的工艺过程及操作要点程及操作要点l理解影响种子质量的因素理解影响种子质量的因素学习目标学习目标种子扩大培养概念：种子扩大培养概念：v种子扩大培养种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为的纯种过程。这些纯种培养物称为种子种子。种子扩大培养的种子扩大培养的原因原因工业生产规模的增大工业生产规模的增大 需要种子就增多需要种子就增多 种子的扩大培养种子的扩大培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的培养物。足够的培养物。菌种扩大培养菌种扩大培养（1）为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。（2 2）发酵时间的长短与接种量的大小有关，接种量大，）发酵时间的长短与接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。发酵时间则短。（3 3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。染菌的机会。（4 4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长）对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。种种子子质质量量的的优优劣劣对对发发酵酵生生产产起起关关键键作作用用。其其生生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。种子液种子液(几或几十立方米几或几十立方米)按按按按10%10%接种量接种量接种量接种量发酵罐发酵罐(几十或几百立方米几十或几百立方米)由实验室制备到车间生产由实验室制备到车间生产的过程的过程作为种子的要求：作为种子的要求：1)1)、菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短、菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短2)2)、生理性状稳定、生理性状稳定3)3)、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求4)4)、无杂菌污染、无杂菌污染5)5)、保持稳定的生产能力、保持稳定的生产能力第一节第一节 种子制备工艺种子制备工艺u固体培养法固体培养法u液体培养法液体培养法(两类）两类）v操作步骤操作步骤v培养设备培养设备v优缺点优缺点1、固体培养法、固体培养法v培养类型培养类型2、液体培养法、液体培养法静置培养静置培养通气培养通气培养厌氧发酵罐厌氧发酵罐摇瓶或种子罐摇瓶或种子罐通气量充足，溶氧好，菌体生长快，通气量充足，溶氧好，菌体生长快，适合菌丝的种子制备适合菌丝的种子制备v种子制备的过程大致可分为：种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段生产车间种子制备阶段 一、一、实验室种子制备实验室种子制备 保藏在沙土管、冷冻干燥管或斜面上的菌种经保藏在沙土管、冷冻干燥管或斜面上的菌种经无菌操作接入适合于孢子发芽或者营养体生长的斜无菌操作接入适合于孢子发芽或者营养体生长的斜面培养基上，经培养成熟后挑选正常的孢子或营养面培养基上，经培养成熟后挑选正常的孢子或营养菌体再一次接入试管斜面反复培养几代。菌体再一次接入试管斜面反复培养几代。这一阶段也称为活化，目的是这一阶段也称为活化，目的是使保藏的菌种达使保藏的菌种达到正常稳定的生长代谢速度。到正常稳定的生长代谢速度。斜面活化的菌种进一步扩大培养，根据菌种特斜面活化的菌种进一步扩大培养，根据菌种特性的不同可采用不同的培养方法。性的不同可采用不同的培养方法。可可采采用用固固体体培培养养基基培培养养孢孢子子，直直接接作作为为种种子子罐罐的的种种子。子。举举例例:产产黄黄青青霉霉菌菌，采采用用大大米米或或小小米米为为固固体体培培养养基基，装装入入摇摇瓶瓶、灭灭菌菌，要要注注意意控控制制米米粒粒含含水水量量，使使米米粒粒不不粘粘不不散散。接接入入孢孢子子，25-28培培养养14d。培培养养结结束束，将将孢孢子子瓶瓶于于真真空空下抽去水分，使含水量下抽去水分，使含水量10以下，冰箱保存备用。以下，冰箱保存备用。产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种菌种 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。通过实验室种子扩培获得一定数量和质量的菌体通过实验室种子扩培获得一定数量和质量的菌体。斜斜面面菌菌种种于于3232，培培养养18-24h18-24h，即即可可移移入入250mL250mL摇摇瓶瓶液液体体培培养养基基，3232培培养养12h12h，即即可可作作种种子罐种子。子罐种子。例如例如：谷氨酸棒状杆菌。：谷氨酸棒状杆菌。不产孢子的菌种不产孢子的菌种 一一般般保保存存在在麦麦芽芽汁汁琼琼脂脂培培养养基基或或MYPG培培养养基基的的斜斜面面上，上，4冰箱保存冰箱保存.每年移种每年移种3-4次。次。斜斜面面菌菌种种接接入入含含10mL麦麦芽芽汁汁试试管管25-27培培养养2-3d扩扩大大至至三三角角瓶瓶25培培养养2d移移至至含含5-10L麦麦芽芽汁汁的的罐罐15-20培养培养3-5d含含100L麦芽汁的发酵罐麦芽汁的发酵罐。生产啤酒的酵母菌生产啤酒的酵母菌MYPGMYPG培养基：培养基：3g3g麦芽浸出物，麦芽浸出物，3g3g酵母浸出物，酵母浸出物，5g5g蛋白胨蛋白胨,10g,10g葡萄糖葡萄糖,20g,20g琼脂琼脂,1L,1L水。水。除蛋白质、盐类、维除蛋白质、盐类、维生素外能溶于水的浸生素外能溶于水的浸出物质，包括含氮浸出物质，包括含氮浸出物和无氮浸出物。出物和无氮浸出物。二、生产车间种子制备二、生产车间种子制备 采采用用易易被被菌菌利利用用的的成成分分，如如葡葡萄萄糖糖、玉玉米米桨桨、磷磷酸酸盐盐等等，同同时时还还需需供供给给足足够够的的无无菌菌空空气气并并不不断断搅搅拌拌，使使菌菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。种子罐培养原则：种子罐培养原则：以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做种以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做种子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对种子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对种子的要求。子的要求。摇瓶菌丝体种子摇瓶菌丝体种子：种子罐之间或发酵罐间的移种种子罐之间或发酵罐间的移种：接种方法：接种方法：可在火焰保护下接入种子可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。罐或采用压差法接入。主主要要采采用用压压差差法法，由由种种子子接接种种管管道道进进行行移移种种，移移种种过过程程中中要要防止接受罐表压降至零防止接受罐表压降至零.种子罐级数的确定种子罐级数的确定种子罐级数种子罐级数指制备种子需扩大培养的次数指制备种子需扩大培养的次数.种子罐的作种子罐的作种子罐的作种子罐的作用？用？用？用？种子制备的工艺过程中，因菌种不同，一种子制备的工艺过程中，因菌种不同，一般可以分为一级种子、二级种子和三级种子。般可以分为一级种子、二级种子和三级种子。种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌体生长速度、产物品种、生产规模及发酵设体生长速度、产物品种、生产规模及发酵设备的合理利用率。备的合理利用率。一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵。依次类推依次类推可知发酵的级数可知发酵的级数=种子级数种子级数+1+1v种子罐级数的意义：种子罐级数的意义：种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少移种带来染菌机会。并可减少移种带来染菌机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。因此，间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数种子罐级数不宜过少不宜过少。一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵发酵1、斜面培养、斜面培养培养基培养基：蛋白胨蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%，pH 7.07.2。培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件培养条件：32，生长，生长1824h。生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传生长良好，所使用斜面连续传代不超过代不超过3次。次。2.一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）培养条件培养条件：于：于1000mL三角瓶中，装液三角瓶中，装液200 250mL，32培养培养12h。培养基培养基：葡萄糖：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5 K2HPO4 0.1%。培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基。料已经基本接近于发酵培养基。培养条件培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的：在种子罐中培养（容积为发酵罐的 1%），），32培养培养710h。培养基培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解 糖代替，浓度为糖代替，浓度为2.5%。培养基的特点培养基的特点：菌体生长，更接近于发酵培养基。：菌体生长，更接近于发酵培养基。3、二级种子（种子罐）、二级种子（种子罐）v10 108 810 109 9cfu/mLcfu/mL。（。（菌数菌数）v大小均匀，呈单个或八字排列。（大小均匀，呈单个或八字排列。（菌体菌体）vpH 7.0pH 7.07.27.2时结束。（时结束。（性能性能）v活力旺盛。（活力旺盛。（活力活力）种子的质量要求种子的质量要求：二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程：制备过程：安瓿管安瓿管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等。蛋白胨等。培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细。有利于长孢子，用量少而精细。培养条件：培养条件：25、7d，注意湿度，注意湿度50%左右。左右。1 1、斜面孢子、斜面孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）。培养基：大米及氮源（玉米浆）。培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。有利于孢子的生长。培养条件：培养条件：25、7d，控制湿度。，控制湿度。大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4106个孢子。个孢子。2 2、大米孢子、大米孢子3、一级种子、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆。培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆。目的目的：菌体生长。菌体生长。培养条件：培养条件：27，40h。接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/t。4、二级种子、二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、1014h。接种量：接种量：10%。种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于空孢，处于期。期。青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，14为年青期，为年青期，46期合成青霉素的能期合成青霉素的能力最强。力最强。v种子制备方法种子制备方法v实验室种子制备工艺实验室种子制备工艺v生产车间种子制备工艺生产车间种子制备工艺复习上一课内容复习上一课内容v种子质量标准种子质量标准v种子质量判断方法种子质量判断方法v影响孢子质量的因素影响孢子质量的因素v影响种子质量的因素影响种子质量的因素第三节第三节 影响种子质量的因素影响种子质量的因素v培养基培养基v培养条件培养条件v种龄种龄v接种量接种量影响种子质量的因素影响种子质量的因素v生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。要原因是原材料质量波动。v营养成分适合种子培养的需要营养成分适合种子培养的需要v营养成分要尽可能与发酵培养基相近营养成分要尽可能与发酵培养基相近1.培养基培养基v温度温度v溶解氧溶解氧一般前期需氧量少，后期需氧量较多。一般前期需氧量少，后期需氧量较多。v逐级的接近发酵培养的条件逐级的接近发酵培养的条件2.培养条件培养条件v种龄种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种子罐或发酵罐时的培养时间。v通常种龄是以处于通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。v不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。样的，一般需经过多种实验来确定。3.种龄种龄v接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。体积的比例。v通常接种量，细菌通常接种量，细菌15%15%，酵母菌，酵母菌510%510%，霉菌，霉菌715%715%，有时，有时2025%2025%4、接种量、接种量v接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。殖的速度。采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。过大会引起溶氧不足，影减少杂菌的生长机会。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。A A 菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查 生生产产菌菌种种，必必须须保保持持稳稳定定的的生生产产能能力力，虽虽然然菌菌种种保保藏藏在在休休眠眠状状态态的的环环境境中中，但但微微生生物物或或多多或或少少会会出出现现变变异异的的危危险险，因因此此定定期期考考察察及及挑挑选选稳稳定定菌种十分重要菌种十分重要。方方法法：取取少少许许菌菌种种，逐逐级级稀稀释释，划划线线培培养养。挑挑出出形形态态整整齐齐、孢孢子子丰丰满满的的菌菌落落，摇摇瓶瓶试试验验，测测定生产能力。定生产能力。种子质量的控制种子质量的控制B B 无无(杂杂)菌检查菌检查 种种子子制制备备过过程程中中，每每移移种种一一步步，均均需需进进行行杂杂菌菌检查。检查。方方法法：镜镜检检、肉肉汤汤或或平平板板培培养养、种种子子液液生生化化分分析。析。生生化化分分析析项项目目：营营养养消消耗耗的的速速度度、pHpH变变化化、溶溶氧利用情况、色泽、气味有否异常等。氧利用情况、色泽、气味有否异常等。