肥达试验和沉淀反应实验报告.docx

实验报告
实验名称
肥达试验
实验日期

院 系

专 　　 业

班 　　 级

姓 　名

学　　 号

一、实验目得
学会肥达反应得原理、方法以及结果分析。理解肥达反应在伤寒与副伤寒杆菌感染检测中得应用。

二、实验器材
试剂：
生理盐水、患者血清、伤寒杆菌H菌液、伤寒杆菌Ｏ菌液、甲型副伤寒杆菌H液、乙型副伤寒杆菌H菌液
器材:
水浴锅、冰箱、小试管3２支、试管架、记号笔、移液枪

三、实验原理
1、伤寒杆菌有三种抗原:分别为菌体抗原(Ｏ抗原）、鞭毛抗原(H抗原)、体表抗原(Ｖｉ抗原）。其中以O抗原及Ｈ抗原得抗原性较强,而Vi抗原得抗原性不强,且相应抗体效价低且为时短暂,随细菌得消除而消失,故不列为肥达试验得检测项目。(但其检查有助于发现伤寒带菌者。）当抗原遇到特异性抗体(抗Ｏ及抗H）时,便会发生凝集反应,通过对凝集物量多少来推算病人体内抗体得多少,以协助诊断、治疗及判断预后。
2、用已知得伤寒沙门菌菌体(Ｏ)抗原与鞭毛（H)抗原,以及引起副伤寒得甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌H抗原得诊断菌液与受检血清做试管或微孔板凝集实验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价得试验。

四、实验过程及步骤
１、 取清洁小试管3２支，分成4排,每排８支,依次编号。
2、32支小试管,用移液枪各注入０、5ml生理盐水。
3、第一管内加入１:10稀释得患者血清0、５ml,用1ｍl吸管吹吸三次，混匀,吸出0、5ml注入第二管作对倍稀释,……依次稀释至第７管,弃去０、5mｌ,第8管为对照。第二排、第三排、第四排以相同步骤加入患者血清。
４、 第一排各管内注入伤寒杆菌H菌液0、５ml;第二排各管注入伤寒杆菌O菌液0、5ml;第三排各加入甲型副作寒杆菌H液０、5ml；第四排各管加入乙型副伤寒杆菌H菌液0、５ml。
5、 置于56℃水浴箱2~４小时。
6、放冰箱过夜或放３7℃水浴箱１８小时后观察结果。
７、　结果观察
最强：上液澄清,细菌全部凝集沉淀于管底。
强:上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。
弱:上液混浊,细菌少部分凝集。
不凝:液体呈乳状与对照管相同。

五、实验总结
1、结果与分析：
先观察对照管，正确结果应无凝集现象，再观察各试验管得凝集现象,凝集程度以“＋”多少表示之。
(+＋+)最强,上液澄清,细菌全部凝集沉淀于管底。
(＋+)强,上液轻度混浊,细菌大部分凝集沉淀于管底。
(+)弱,上液混浊,细菌少部分凝集。
(－）不凝,液体呈乳状与对照管相同。
效价判定：以能出现“++”凝集现象得血清最高稀释度为该血清得凝集效价。
一般认为Ｏ抗体效价在1:８０以上，H抗体效价在1:1６0以上,有辅助诊断意义。
H甲或H乙达到1：80或以上具有诊断意义。
但在分析结果时,应注意以下两点:
(1）非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过伤寒,副伤寒,以及回忆反应等原因，也可呈现阳性结果。不过,由这些原因所引起得阳性反应主要就就是Ｈ抗体升高,O抗体效价一般不高,同时,每隔５～7天试血一次，其抗体效价一般不会随病程而升高。上述这些都有别于现症感染。
（2)少数肠热症患者，由于发病初期曾使用大量抗生素,或机体有免疫缺陷病,或机体反应性极弱等原因,抗体效价可以很低，甚至为阴性结果。
因此不能只根据肥达氏试验得结果去作简单肯定或否定得结论,必须结合当地流行情况，既往接触史，以及临床症状与体征,做出正确得判断。
2、肥达反应得诊断标准:
肥达反应就就是诊断伤寒副伤寒得辅助诊断，其结果得解释必须结合临床变现与病程,病史,以及地区流行病学情况。
机体患伤寒、副伤寒,一般于发病后1～２周内血液中出现特异性抗体并且随着病程延长而效价渐升，此时即可为阳性，第4周可达峰值,以后又逐渐降低。
一般以“Ｏ”凝集效价在1／8０或以上与"H”在１／１6０或以上为阳性。
O抗体主要就就是ＩgＭ,出现较早；Ｈ抗体主要就就是IgG，出现较晚。根据此特点，肥达试验结果有如下诊断价值:
二者均超过正常值,患伤寒得可能性大;
二者均在正常值内,患伤寒得可能性小;
H抗体效价超过正常值，O抗体效价正常,可能就就是接种了伤寒菌苗或者就就是接种得回忆反应;
O抗体效价超过正常值,H抗体效价正常,可能就就是伤寒早期或者其她沙门氏菌感染;
一般间隔1~２周复查,若抗体效价比前次结果增高2~4倍,则具有诊断价值。

六、教师评价

实验报告
实验名称
沉淀反应
实验日期

院　　　 系

专 　 业

班 　 级

姓　 　 名

学 号

一、实验目得
掌握对流免疫电泳得原理与方法,了解其用途。

二、实验器材
器材:
电子天平、锥形瓶、200ｍｌ量筒、药匙、称量纸、水浴锅、微波炉、洗耳球、玻片、移液管、
废液缸、打孔器、胶头滴管、移液枪、镊子、纱布条、电泳槽
试剂：
pH8、6 0、05mｏｌ/L巴比妥缓冲液、琼脂粉

三、实验原理
1、对流免疫电泳也称反向免疫电泳或免疫电渗电泳,其实质就就是定向加速得电泳技术与免疫双扩散技术得结合。抗原与抗体在一定得pH条件下,由于带电荷量得多少及分子量大小不同，在电场中以不同得速度作定向移动。在pH８、６得缓冲液中,多数蛋白质抗原物质带负电荷,在电场作用下向阳极移动；而其抗体大多为γ球蛋白,等电点较高，带负电荷较少,且分子量较大,电泳速度慢，受电渗作用影响向负极移动。由于抗原抗体孔相对排列,当两者比例适当时，特异性抗原抗体互相结合形成肉眼可见得白色沉淀线。同时,由于电场限制了抗原抗体分子得自由扩散,从而提高了试验得敏感性，且缩短了试验时间。此法可用于抗原或抗体得快速诊断。但缺点就就是分辨力低,较复杂得抗原抗体系统不宜用此法。
2、在一定温度与电解质存在得条件下,可溶性抗原与相应抗体在比例合适处形成肉眼可见得沉淀线,称为沉淀反应(pｒｅciｐｉtａtiｏnreａcｔioｎ）。参与反应得抗原称为沉淀原,抗体称为沉淀素。可溶性沉淀原分子小,单位体积内所含得抗原量多，与抗体结合得总面积大,故试验时需对抗原进行稀释,确保抗原与抗体以合适得比例结合，并以抗原得稀释度作为沉淀反应得效价。
目前广泛应用得沉淀反应就就是凝胶免疫扩散（Ａgar—gelimｕnodiffusｉon)。在凝胶内电解质得参与下,特异性抗原、抗体在凝胶内扩散并相遇，免疫复合物在最适比例处(在平衡区带,即抗体决定簇得数目等于抗原决定簇数目时)发生沉淀。常用得１~２％琼脂凝胶形成得构架网孔较大，允许分子量在20万以下得物质(如绝大多数可溶性抗原与抗体）通过,在凝胶中自由扩散。而免疫复合物因颗粒较大不扩散，形成沉淀线。这种沉淀线就就是一组抗原抗体得特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时,便依各自扩散速度得差异,在适当部位形成独立得沉淀线,因此广泛地用于抗原成分得分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应得方式与特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫固定电泳等试验。
以下为对流免疫电泳测定血清中得AＦP。
四、实验过程及步骤
任务一：制备巴比妥琼脂板
１、电子天平称取０、500g琼脂粉,加入锥形瓶，用量筒量取50mｌ pH8、6 ０、0５mｏl/L巴比妥缓冲液加入锥形瓶。混匀后微波炉加热2分钟。再放入5６℃恒温水浴锅中。
（0、05ml／LpH８、6巴比妥缓冲液得配制方法:巴比妥-1、84g;巴比妥钠－10、3g;加蒸馏水至１000mｌ)
2、取４、５ml 已融化得1%巴比妥琼脂溶液滴于载玻片上
提示：
（1)所用载玻片要洁净、边缘无破损，否则难以浇制琼脂板,可用７5%乙醇冲洗干净,晾干备用。
(2)吸取琼脂溶液得量,太少不能铺满整张玻片,太多将溢出玻片,都会导致琼脂板制备失败。
（3)浇制琼脂板时动作要迅速,过于缓慢容易边加边凝,使琼脂板凹凸不平。
任务二：打孔
1、待琼脂板凝固后在琼脂板中间部分打四个孔,孔径3ｍm,孔距10mm。在左上角打一个孔作为标记。用胶头滴管吸去空上废液。
提示:
(１)打孔时要小心，勿使琼脂层脱离载玻片或琼脂板底层开裂，以免加样时顺裂缝或底部散失。一旦出现裂缝或脱离现象,可向孔内滴加少许温琼脂加以弥补或将琼脂板在火焰高处来回通过几次补底。
(2)在琼脂板左上角打上标记孔,有助于确定正负极方向与样本上样位置,通常情况下,有标记孔侧,放置于正极端。
任务三:加样
１、如下图所示加样，用移液枪每个孔加10微升对应液体:

Ｃ:人待测血清; 　D:人阳性血清; 　E:抗人血清抗体/诊断血清
提示:
(1)抗原与抗体在一定得ｐH条件下，由于带电荷量得多少及分子量大小不同,在电场中以不同得速度作定向移动。在pH8、6得缓冲液中，多数蛋白质抗原物质带负电荷,在电场作用下向阳极移动,而其抗体大多为Ｙ球蛋白，等电点较高,带负电荷较少，且分子量较大,电泳速度慢,受电渗作用影响向负极移动。
(2）加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡,以免影响扩散结果。
（3)抗原、抗体得量应相接近时容易出现沉淀带，反之不易发生,如抗原过多,可造成假阴性结果,可通过稀释抗原加以解决。
任务四:正确放置琼脂板至电泳槽
1、向电泳槽中加入约2/3体积得pＨ8、6 0、０5mol/L巴比妥溶液,将加好样得琼脂板放入电泳槽,有标记孔得一侧放在正极端。
2、用纱布条搭在琼脂板两侧，以便电泳。
提示:
(１)电泳时抗原、抗体电极方向不可放反。
(2)搭桥时应注意与凝胶接触紧密,否则会使电流不均匀，致使沉淀线歪斜、不均匀。
任务五：确定电泳电压
１、设置电泳仪Ｕｓ=6Ｖ,Ｉs=4mＡ,Ts=６0:00
提示:
电压、电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形,可将琼脂融化,电流过大抗原抗体蛋自易变性,干扰实验结果;电压过低时沉淀线出现得时间会延长。

五、实验总结
１、待测孔与抗血清之间出现白色沉淀线为阳性,不出现白色沉淀线为阴性。如沉淀线不清晰,可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽中过夜再观察。

六、教师评价