微生物生态学基本研究方法.pptx

第三章：微生物生态学的基本研究方法第三章：微生物生态学的基本研究方法2024/9/7 周六1参考书参考书l陈声明，林海萍，张立钦主编，微生物生态学导论，陈声明，林海萍，张立钦主编，微生物生态学导论，高等教育出版社，高等教育出版社，20072007l池振明主编，池振明主编，20052005，现代微生物生态学，科学出版社，现代微生物生态学，科学出版社l杨家新主编，杨家新主编，20042004，微生物生态学，化学工业出版社，微生物生态学，化学工业出版社l宋福强主编，宋福强主编，20082008，化学工业出版社，化学工业出版社l张素琴张素琴著：著：20052005，科学出版社科学出版社lMolecular Microbial Ecology,A.Mark Osborn&Cindy J.Smith,Taylor&Francis Group,20052024/9/7 周六22024/9/7 周六3专业期刊专业期刊Microbial EcologyApplied and environmental microbiologyAdvances in microbial ecologyISME JournalApplied Microbiology and BiotechnologyFEMS Microbiology EcologyFrontiers in MicrobiologyGeomicrobiology Journal Nature Microbiology Review2024/9/7 周六4你们能够想到什么方法开展你们能够想到什么方法开展微微生物生态学生物生态学的研究的研究？微生物生态学？研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门学科关注的内容：主要研究微生物的分布、种群组成、数量和活力等与环境的关系，以及微生物之间、微生物与高等有机体之间的相互关系。2024/9/7 周六51 1、经典技术和方法、经典技术和方法 直接观察测定直接观察测定 培养研究培养研究2 2、生理生化方法、生理生化方法3 3、分子生物学方法、分子生物学方法4 4、稳定同位素方法、稳定同位素方法2024/9/7 周六61 1、经典技术和方法、经典技术和方法直接观察测定直接观察测定l利用显微镜对样品中的微生物直接观察利用显微镜对样品中的微生物直接观察l计算数目，测定丝状微生物长度（普通染色、荧光计算数目，测定丝状微生物长度（普通染色、荧光染色）染色）l优点：直接观察天然样品中微生物的形态和微生物优点：直接观察天然样品中微生物的形态和微生物所处的位置所处的位置l缺点：样品量少，代表性差缺点：样品量少，代表性差2024/9/7 周六7HepG2CellsStainedUsingtheLIVE/DEADCellImagingKit,showinggreen-fluorescentlivecellsandred-fluorescentdeadcells.HeLa cells showing negative staining by ICC/IF using only secondary antibody.The cells were 100%methanol fixed(5 min)and then incubated in 1%BSA/10%normal goat serum/0.3M glycine in 0.1%PBS-Tween for 1h to permeabilise the cells and block non-specific protein-protein interactions.The secondary antibody(red)was ab150091 Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG(Fc)used at 2g/ml for 1h.DAPI was used to stain the cell nuclei(blue)at a concentration of 1.43M.2024/9/7 周六82024/9/7 周六9Archaea in the picture in red,sulfate reducing Bacteria in green.Credit:Annelie Pernthaler/UFZ FISH技术2024/9/7 周六101、经典技术和方法培养研究对采集的样品进行稀释、培养辨认培养物的种类2024/9/7 周六112024/9/7 周六12（1 1）基内菌丝与培养基结合紧密，不易挑起；）基内菌丝与培养基结合紧密，不易挑起；（2 2）菌落边缘有辐射的菌丝，称为辐射状菌丝；）菌落边缘有辐射的菌丝，称为辐射状菌丝；（3 3）生长后期表面形成紧密的绒毛状或坚实、干燥、）生长后期表面形成紧密的绒毛状或坚实、干燥、不透明、多皱的表面，上面常有一层色彩鲜艳的干粉；不透明、多皱的表面，上面常有一层色彩鲜艳的干粉；（4 4）可形成絮状或颗粒状的典型菌落，菌落的正反面）可形成絮状或颗粒状的典型菌落，菌落的正反面颜色往往不一致，菌落边缘培养基的平面有变形现象；颜色往往不一致，菌落边缘培养基的平面有变形现象；（5 5）有特殊气味（土霉气味）等。）有特殊气味（土霉气味）等。2024/9/7 周六132024/9/7 周六142024/9/7 周六15细细菌菌菌菌落落2024/9/7 周六161、经典技术和方法培养研究n优点：能对活的微生物进行计数，并能区分真菌、放线菌和细菌n缺点：可培养率很低1%;单菌落是否由一个细菌繁殖而来；丝状微生物菌落究竟是由孢子而来还是由菌丝而来难以区分2024/9/7 周六17经典的观察和培养方法能够在一定程度上告诉我们经典的观察和培养方法能够在一定程度上告诉我们样品中微生物的数量、可培养微生物的数量及类型。样品中微生物的数量、可培养微生物的数量及类型。但这些结果不能告诉我们微生物在样品中能干什么但这些结果不能告诉我们微生物在样品中能干什么？2024/9/7 周六18包括用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法、底物包括用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法、底物诱导呼吸法和光合微生物色素法等；诱导呼吸法和光合微生物色素法等；用于测定土壤用于测定土壤C C矿化速率和微生物呼吸强度等方法；矿化速率和微生物呼吸强度等方法；用于测定土壤中物质转化的生物活性和酶活性的分用于测定土壤中物质转化的生物活性和酶活性的分析方法；析方法；测定微生物能量代谢的分析方法等测定微生物能量代谢的分析方法等2 2、生理生化方法、生理生化方法2024/9/7 周六19代谢活力研究：代谢活力研究：放射性放射性/稳定稳定同位素标记记某种代谢物，同位素标记记某种代谢物，测定代谢活力测定代谢活力C C1414，C C1313，H H3 3，N N1515酶活性测定酶活性测定ATPATP含量测定：含量测定：ATPATP仅存在仅存在于活的细胞中，且在细胞中于活的细胞中，且在细胞中的含量基本一致的含量基本一致ATP检测仪2024/9/7 周六20代谢活力研究l叶绿素含量测定：估计藻类和光合细菌的生物量和代谢活力l土壤呼吸速率测定：间接估计土壤中的生物量，不适于仅有厌氧呼吸或发酵的微生物测定土壤呼吸测定仪2024/9/7 周六21代谢活力研究代谢活力研究优点：能确定样品中微生物能做什么；优点：能确定样品中微生物能做什么；缺点：无法说明样品究竟是哪些微生物缺点：无法说明样品究竟是哪些微生物在起作用，样品存在哪些微生物种类和在起作用，样品存在哪些微生物种类和微生物在自然样品中的分布情况微生物在自然样品中的分布情况2024/9/7 周六22lBiologBiolog微平板法微平板法lPLFAPLFA图谱分析图谱分析2024/9/7 周六23Biolog Biolog 微生物自动分析系统是美国微生物自动分析系统是美国Biolog Biolog 公司从公司从1989 1989 年开始推出的一套年开始推出的一套微生物鉴定系统微生物鉴定系统，最早进入，最早进入商品化应用的是商品化应用的是G G-好氧细菌鉴定数据库好氧细菌鉴定数据库(GN),(GN),其后陆其后陆续推出续推出G G+好氧细菌好氧细菌(GP)(GP)、酵母菌、酵母菌(YT)(YT)、厌氧细菌、厌氧细菌(AN)(AN)和丝状真菌和丝状真菌(FF)(FF)鉴定数据库。鉴定数据库。Biolog Biolog 系统系统6101 6101 版数据库共包括版数据库共包括1973 1973 种微生物，种微生物，其中细菌其中细菌234 234 个属，个属，1 226 1 226 个种，与其他鉴定系统个种，与其他鉴定系统相比，其微生物种类的数据量较大，适合于环境、食相比，其微生物种类的数据量较大，适合于环境、食品、工业、临床和动植物病原菌的鉴定分析。品、工业、临床和动植物病原菌的鉴定分析。BIOLOGBIOLOG微平板法微平板法2024/9/7 周六24Biolog Biolog 自动微生物分析系统主要根据细菌对糖、醇、自动微生物分析系统主要根据细菌对糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等酸、酯、胺和大分子聚合物等95 95 种碳源的利用情况种碳源的利用情况进行鉴定。进行鉴定。细菌利用碳源进行呼吸时细菌利用碳源进行呼吸时,会将会将四唑类氧化还原染色四唑类氧化还原染色剂剂(TV)(TV)从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板上形从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板上形成该菌株特征性的反应模式或成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱指纹图谱”。通过纤维光学读取设备通过纤维光学读取设备读数仪来读取颜色变化读数仪来读取颜色变化,由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹指纹图谱图谱”与数据库相比较，将目标菌株与数据库相关菌与数据库相比较，将目标菌株与数据库相关菌株的特征数据进行比对，获得最大限度的匹配株的特征数据进行比对，获得最大限度的匹配,可以可以在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的菌株的属名或种在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的菌株的属名或种名。名。2024/9/7 周六25BIOLOG ECOBIOLOG ECO微平板微平板含含3 3组相同的碳源，根据平均颜色变化情况，计算组相同的碳源，根据平均颜色变化情况，计算微生物群落的多样性指数、代谢特征的变化等。微生物群落的多样性指数、代谢特征的变化等。2024/9/7 周六262024/9/7 周六27四氯唑染料四氯唑染料96孔微孔板孔微孔板2024/9/7 周六28培养时间(h)浅层含水层沉积物中微生物群落培养过程中浅层含水层沉积物中微生物群落培养过程中AWCD的变化的变化2024/9/7 周六29赵锐等，20102024/9/7 周六30赵锐等，20102024/9/7 周六31赵锐等，20102024/9/7 周六32磷脂类化合物只存在于细胞膜中，不同微生物其磷磷脂类化合物只存在于细胞膜中，不同微生物其磷脂脂肪酸组成和含量都不相同。脂脂肪酸组成和含量都不相同。一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物马上降解。一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物马上降解。因此该方法十分适合于因此该方法十分适合于微生物群落的动态监测。微生物群落的动态监测。PLFAPLFA图谱分析图谱分析2024/9/7 周六33细胞膜磷脂双分子层细胞膜磷脂双分子层2024/9/7 周六34毛细管柱2024/9/7 周六35Typical GC-FID signal of extracted PLFAs under(a)landfill gas ddition(W+LG)and(b)the control treatment(W,grey colour in the enlargement)in 20 cm soil depth.(1)i14:0,(2)14:0,(3)i15:0,(4)a15:0,(5)15:0,(6)i16:0,(7)16:1o8c,(8)16:1o7c,(9)16:1o6c,(10)16:1o5c,(11)16:0,(12)10Me16:0,(13)i17:0,(14)a17:0,(15)17:1o8c,(16)cy17:0,(17)17:0,(18)10Me17:0,(19)18:2o6,9,(20)18:1o9c,(21)18:1o8c,(22)18:1o7c,(23)18:0,(24)cy19:0,(IS)internal standard 19:0.Watzinger et al.,2008,Soil Biology&Biochemistry 40(2008)7517622024/9/7 周六363 3、分子生物学、分子生物学2024/9/7 周六373 3、分子生物学方法、分子生物学方法(G+C)(G+C)摩尔百分含量摩尔百分含量核酸探针杂交技术核酸探针杂交技术DNA-DNADNA-DNA杂交杂交DNADNA序列分析序列分析基因芯片基因芯片宏基因组学宏基因组学基于基于PCRPCR的指纹图谱分析的指纹图谱分析2024/9/7 周六382024/9/7 周六39周继中Oklahoma2024/9/7 周六403 3、分子生物学方法、分子生物学方法基于基于PCRPCR的指纹图谱分析的指纹图谱分析DGGE/TGGEDGGE/TGGE单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCPSSCP）技术）技术RAPD(random amplified polymorphic DNA)RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术技术限制性片段多态性（限制性片段多态性（RFLP:restriction fragment length RFLP:restriction fragment length polymorphismpolymorphism）/扩增性扩增性cDNAcDNA限制性酶切片段分析（限制性酶切片段分析（ARDRA:ARDRA:amplified ribosomal DNA restriction analysisamplified ribosomal DNA restriction analysis）末端限制性片段长度多态性（末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)T-RFLP)核糖体基因间隔序列分析（核糖体基因间隔序列分析（RISA:ribosomal intergenic spacer RISA:ribosomal intergenic spacer analysisanalysis）/自动核糖体基因间隔序列分析（自动核糖体基因间隔序列分析（ARISAARISA）扩增片段长度多态性（扩增片段长度多态性（AFLPAFLP）高度重复序列或微卫星区域高度重复序列或微卫星区域2024/9/7 周六412024/9/7 周六42稳定性同位素探针(stable isotope probing,简称SIP)要先将标记的底物13C(或15N)添加到系统中,然后再提取微生物群落DNA，用梯度离心法把重的DNA(被13C或15N 标记)和轻的DNA(未被13C 或15N 标记)分开。用群落DNA 分析方法分别对重DNA 和轻DNA 进行分析,可以了解活性和非活性微生物群落,从而知道哪些微生物在起作用。SIP 技术非常明显的优点是可以明确群落中实际起作用的微生物,但也有一些缺点。如不易检测数量很少但活性很高的微生物的活性;鉴于DNA中要求N 的含量相对较低，SIP 技术比较适合研究与碳素转化有关的活性微生物群落。4 4、稳定、稳定同位素同位素?方法方法2024/9/7 周六43什么是微生物生态学？微生物生态学的研究方法有哪些？每种方法的优缺点是什么？举例说明上上节内容回顾节内容回顾 2015.12.12015.12.12015.12.12015.12.12024/9/7 周六442024/9/7 周六45基本知识基本知识氨氧化氨氧化NH3+NO2-NO3-硝化作用硝化作用 amoA（功能基因）（功能基因）氨氧化细菌（氨氧化细菌（AOB）,氨氧化古菌氨氧化古菌（AOA）抑制剂的使用：抑制剂的使用：（1）dicyandiamide(DCD,双氰胺)，allylthiourea（烯丙基硫脲），Nitrapyrin（三氯甲基吡啶）【对AOA和AOB均有抑制性，但对AOB的抑制作用更强】；（2）karrnamycin；sulfathiazole（磺胺噻唑）抗生素类，AOB；（3）NO-scavenger carboxy-PTIO【强烈抑制AOA，对AOB影响不大】二者的功能基因的序列不同，可以用不同的引物分别扩增二者的功能基因的序列不同，可以用不同的引物分别扩增PNR：potential nitrification rate大多数大多数AOA属于自养型，少数混养型属于自养型，少数混养型2024/9/7 周六462024/9/7 周六47文章剖析文章剖析主要观点：主要观点：强酸性土壤中强酸性土壤中氨氧化古菌比氨氧化细菌对氨氧化所起的作用氨氧化古菌比氨氧化细菌对氨氧化所起的作用更重要更重要涉及到的微生物生态学方法：涉及到的微生物生态学方法：分子生物学（分子生物学（PCR,DGGEPCR,DGGE）稳定同位素标记（稳定同位素标记（SIPSIP）生理生化方法生理生化方法2024/9/7 周六48主主 要要 论论 据据Significantly positive correlations between nitrate concentration and amoA gene abundance of AOA,but not of AOB.13CO2-DNA-stable isotope probing results showed significant assimilation of 13C-labeled carbon source into the amoA gene of AOA,but not of AOB.Addition of the nitrification inhibitor dicyandiamide(DCD,双氰胺)completely inhibited the nitrification activity and CO2 fixation by AOA,accompanied by decreasing thaumarchaeal amoA gene abundance.Bacterial amoA gene abundance decreased in all microcosms irrespective of DCD addition,and mostly showed no correlation with nitrate concentrations.2024/9/7 周六49DCD的加入能强烈抑制土壤中氨氧化作用的进行.无抑制剂添加抑制剂2024/9/7 周六50DCDDCD的加入使的加入使得得AOA AOA amoAamoA基因丰度基因丰度减少减少AOA amoA拷贝数无DCD添加DCD2024/9/7 周六51DCDDCD的加入对的加入对AOB AOB amoAamoA基因的丰度基因的丰度变化影响不大变化影响不大AOB amoA拷贝数无DCD添加DCD2024/9/7 周六52AOA amoA拷贝数NO3-浓度2024/9/7 周六53AOA AOA amoAamoA基因丰基因丰度与度与NONO2 2-浓度正相浓度正相关，而关，而AOB AOB amoAamoA基因与基因与NONO3 3-负相关负相关2024/9/7 周六54稳定同位素标记稳定同位素标记实验（实验（AOAAOA对氨氧化起着重要作用）对氨氧化起着重要作用）无无DCDDCD，NONO3 3-升高升高，NHNH4 4+稳定，稳定，AOA AOA amoAamoA丰度丰度相对相对不变，而不变，而AOB amoAAOB amoA丰度下降。丰度下降。有有DCDDCD，NONO3 3-不变不变，NHNH4 4+上升，上升，AOAAOA和和AOB AOB amoAamoA丰度下降。丰度下降。NH4+浓度2024/9/7 周六55Eightarrowsmarkedthebandsinheavyfractionaroundabuoyantdensityof1.73gml-1excisedforsequencingactive13CO2-labeledAOAbelongedtogroups1.1a-associatedand1.1b.2024/9/7 周六57洞穴微生物生态学洞穴微生物生态学氨氧化微生物生态学氨氧化微生物生态学湿地微生物生态学湿地微生物生态学植物共生微生物生态学植物共生微生物生态学（要求每人下载（要求每人下载1 1篇英文文献，并就该文献的主要论篇英文文献，并就该文献的主要论点、论据、方法和结论等进行解说和释义），交纸质点、论据、方法和结论等进行解说和释义），交纸质版版课后作业课后作业2024/9/7 周六58