叶绿体转基因.doc

叶绿体转基因技术的研究进展
摘 要: 叶绿体转基因技术是近年来发展起来的且是继核转基因技术之后的一个非常有效的改良植物品质的新技术，它呈现出诱人的发展前景。本文综述了叶绿体基因工程的优点和特点、高等植物叶绿体转化技术的现状、叶绿体转化的应用、叶绿体转化技术的局限，并且展望了叶绿体转基因技术的发展方向和应用前景。
关键词: 叶绿体；转基因；优越性

核转基因技术除了对抗除草剂、抗虫性以及抗逆性有关的研究以外，对品质性状相关的研究将会变得越来越重要，例如,改进油料作物脂肪的组成、增加必需氨基酸和蛋白质的含量等。核转基因技术已显示出它的优越性，但叶绿体转基因技术也有其优点。
叶绿体是植物细胞中与光合作用直接相关的细胞器，也是淀粉、脂肪酸、叶绿素、胡萝卜素、嘌呤、嘧啶及大部分氨基酸的合成场所，它在植物中发挥着重要作用。
近年来，由于重组DNA和基因工程等现代分子生物学技术的应用，包括用限制性内切酶绘制物理图谱、基因定位、分离、扩增和鉴定，以及DNA序列快速分析法，完成了多种植物叶绿体基因组的全序列测定，并研究了这些基因的结构、功能与表达。通过对叶绿体的遗传转化即是将外源基因整合入叶绿体基因组的特定位点使其在叶绿体中表达和翻译的研究，显示出叶绿体转基因技术的优越性，它可以改良叶绿体的功能，从而创造出生产上有价值的作物新品种[1-2]。本文综述了叶绿体基因工程的优点和特点、研究现状、转化的应用以及技术的局限，并且展望了叶绿体转基因技术的发展方向和应用前景。

1 叶绿体基因工程的优越性
叶绿体基因工程是以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作, 通过一定方法使外源基因穿过细胞膜和叶绿体双层膜进入叶绿体, 在同源重组片段的介导下与叶绿体基因组之间发生同源重组, 以定点整合方式进入叶绿体基因组, 在其中转录、翻译并获得终产物的技术。这项技术具有许多传统的细胞核转基因技术所不具备的优越性。
(l)表达效率高 研究表明，相对于核转化，叶绿体转化能使外源基因表达量提高100倍以上[3]。
(2)原核基因无需修饰改造 由于叶绿体大多数基因的结构、转录与翻译系统均与原核生物类似，来自原核生物的有重要价值的外源基因，无需改造和修饰就可在叶绿体内高效表达[4-5]。
(3)真核蛋白可正确折叠 研究表明在叶绿体中表达的蛋白可形成二硫键，人类蛋白也可正确折叠[6]。
(4)生物安全性好 对大多数高等植物而言，外源基因整合到叶绿体基因组后，只能进行母系遗传，不像核基因那样可以随花粉扩散。
(5)便于遗传操作叶绿体基因组小，结构简单。
(6)可以实现定点整合 外源基因可通过同源重组定点整合进叶绿体基因组，定点整合有利于控制外源基因的表达，消除了核转化中存在的“位置效应”。
(7)多顺反子共同转录 叶绿体中多个顺反子可共同转录，所以按操纵子形式就可以将很多基因同时导入叶绿体中，从而为转化和表达涉及特定生化反应的多个基因工作提供便利[7]。
(8)可设计适合多种植物转化的通用载体 由于不同物种叶绿体基因组中某些序列呈现高度保守的性质，用这些序列作为同源重组片断构建的载体可适用于多个物种，如用烟草载体转化马铃薯[8]。
(9)可积累有毒蛋白而不影响植物生长[9]。
(10)易保持纯系、后代不分离 一旦得到纯合而稳定的叶绿体转化体，由于外源基因的母系遗传特性，这种纯系的种子后代将永远保持为纯系，不会因为有性杂交而发生分离。
2高等植物叶绿体转化技术的现状
自从1990年Svba等首次发表稳定的烟草叶绿体转化以来，高等植物叶绿体转化技术蓬勃发展，在许多方面取得了引人注目的成就。从叶绿体转化技术涉及的高等植物物种来看，已在烟草[10]、拟南芥[11]、马铃薯[12]、番茄[13]、油菜[14]、棉花[15]等建立了稳定的转化体系，从在叶绿体中表达的基因看，已有三十种左右不同功能的外源基因成功表达，在外源DNA导入叶绿体的手段上，进行了基因枪法、农杆菌转化法、PEG介导法、激光微束穿刺法、花粉管导入法、显微注射法等多种方法的尝试，并用前三种方法成功的获得稳定的叶绿体转化植株。从叶绿体转化技术应用的范围上看，己在基础研究和生物技术领域进行了广泛应用，并取得了许多令人瞩目的成果，尤其是用叶绿体作为植物生物反应器的研究得到了高达46%可溶蛋白的表达水平，显示了此项技术在植物生物反应器方面实际应用于生产实践的潜力。另外，叶绿体转化技术也在不断的完善中。
3叶绿体转化的应用
叶绿体转化系统的建立对叶绿体的分子生物学研究和利用具有重大意义，一方面，这套技术的建立有利于解决诸如叶绿体基因表达调控机制、核质基因的相互作用、叶绿体基因的功能鉴定以及叶绿体进化等许多理论问题。另一方面，由于叶绿体转化在外源蛋白表达方面的各种优越性，使之成为植物生物反应器生产外源蛋白的最佳途径，而目前叶绿体研究的热点也集中与此。
3.1基础研究
叶绿体转化技术的出现对叶绿体分子生物学研究特别有利，因为用体外重组操作方法对叶绿体DNA进行改造，将其导入叶绿体基因组后通过观察和分析各项生理和生化变化，就可以获得以前很难得到的叶绿体分子生物学方面的知识，如叶绿体基因表达调控机制、核质基因的相互作用、叶绿体基因的功能鉴定以及叶绿体进化等[16]。
3.2生物技术领域
高等植物的叶绿体转化一出现就引起生物技术领域的重视，特别是它与核转化体系相比有很多独特的优点，使其成为未来的生物技术热点。目前这个技术主要用于植物性状的改造及作为表达大量外源基因产物的植物生物反应器。
3.2.1植物光合作用的遗传改造:
由于叶绿体是植物的光合作用器官，所以提高作物的光合效率是叶绿体转化技术建立后人们十分关注的工作。如Knaevski等[17]将向日葵的rbcL基因转入烟草叶绿体，以取代烟草自身的rbcL基因，发现在转基因烟草中形成了由向日葵的Rubisoc大亚基和烟草的Rubisoc小亚基构成的完整的有活性的酶。这些工作为优化植物的Rubisco酶的结构，提高光合性能奠定了重要基础。
3.2.2植物的抗性基因工程
除光合作用外，利用叶绿体转化技术进行农作物的品种改良主要集中在对植物的抗病虫性及抗逆性改良方面，其中包括增加植物的抗虫、抗病、抗早、抗除草剂的能力。
在己有的关于叶绿体生物技术方面，以转移杀虫蛋白基因的报道最多。例如:张中林等[18-19] 和侯丙凯等[20]分别将Bt杀虫蛋白基因导入烟草和油菜叶绿体基因组，转基因植株对鳞翅目害虫均表现出较高抗性。
抗除草剂的基因工程中应用叶绿体转化可避免这些外源基因的扩散，提高其生物安全性，所以利用叶绿体转化技术将相关的抗性基因导入叶绿体中更为直接，如前文介绍的工作中有用花粉管通过道法将来自抗该除草剂的龙葵psbA突变基因导入大豆中，并得到母性遗传的阿特拉津抗性植物。
3.2.3叶绿体转化技术在植物生物反应器中应用
用高等植物的叶绿体表达的外源基因的产物不仅量多，而且叶绿体的原核性也使得它适于表达来自原核蛋白的基因，并且有报导表明在叶绿体表达外源基因的蛋白产物有正确折叠及二硫键形成[21] ，这些特性无疑会使得叶绿体表达的药物蛋白在提纯处理的费用大大降低。现在利用高等叶绿体表达体系主要生产的药物类蛋白和疫苗，其中有关药物类基因的工作有:具有多种医用价值的蛋白质类药物“GVGVP”，烟草叶绿体中表达量为细胞核表达的100倍[22]:生长素基因(hST)，烟草叶绿体中最高表达量达总可溶蛋白的7% [21]，比细胞核转化高300倍。
4叶绿体转化技术的局限
高等植物的叶绿体转化技术虽然建立，但至今为止，高等植物中只在茄科、十字花科、锦葵科、伞形科中少数高等植物上获得了稳定的叶绿体转化植株，而且只有在烟草中建立起稳定的转化体系，获得较高的转化效率，而其它物种的转化体系还不够稳定和广泛，转化率也往往偏低，暂时还无法在实际生产中应用。限制高等植物叶绿体转化的瓶颈主要有两点，-是大多数植物(包括重要农作物)的叶绿体基因组序列还不清楚，因此无法确定外源基因合适的插入位点。二是很多植物，特别是重要的禾谷类作物不能从叶片再生，而能够再生的组织(包括愈伤组织、幼胚等)都不含有成熟的叶绿体，只有体积较小的前质体。这些小的质体被认为比基因枪的子弹还小，无法击中。而且前质体中NDA分子数少，也影响筛选标记基因的表达，不利于同质化筛选，因此虽然Dnaien等[23-24]用基因枪对烟草的培养细胞以及小麦幼胚愈伤组织前质体的进行转化，但只得到瞬时表达的结果。
结束语
今后-段时间内，还需大力开展高等植物的叶绿体基因组测序工作，并进一步探索转化非绿色前质体中叶绿体DNA的可能性，以使叶绿体转化技术应用于更多的高等植物物种中。另外，发展简化的同质化方案、建立有效的无抗生素标记基因转化系统以及对可调控的叶绿体外源蛋白表达体系进一步探索也是促进叶绿体转化技术走向实际应用的关键。另外，作为生物改良的有效手段，叶绿体遗传转化能为植物的抗逆性、品质改良等众多领域开创新机会，尤其是生物安全方面的优势[25]，因而加强叶绿体基因转化技术的研究，对育种工作的发展有广泛的前景和深远意义。