果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速测定吉林省地方标准.doc

吉林省质量技术监督局 发布
2023-07-02实行
2023-07-02发布
果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法
Method for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products
-- The real-time PCR method

DB22/T1162—2023
DB22
吉林省地方标准
ICS67.050
X04
备案号：

前 言
本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。
本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。
本标准重要起草单位：吉林省产品质量监督检查院。
本标准重要起草人：史艳宇，刘俊会，华蕾，安伟，李媛媛，逄晓阳，王莹，王伟，李刚等。
本标准系初次发布的地方标准。

果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法
1　 范围
本标准规定了果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的荧光PCR检查方法。
本标准合用于果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测。
2　 规范性引用文献
下列文献中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文献，其随后所有的修改单（不涉及勘误的内容）或修订版均不合用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文献的最新版本。凡是不注日期的引用文献，其最新版本合用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法。
3　 定义、术语和缩略语
下列定义、术语和缩略语合用于本标准。
3.1
脂环酸芽孢杆菌 Alicyclobacillus spp.
脂环酸芽孢杆菌是一群耐热、嗜酸的杆状芽孢菌，革兰氏染色为阳性至可变，其在pH范围2.0~6.0，温度为45℃时生长良好。
3.2 缩略语
3.2.1 PCR：polymerase chain reaction，简称PCR。　　
3.2.2 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。　　
3.2.3 dNTP: deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。
3.2.4 dATP: deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。
3.2.5 dCTP: deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。
3.2.6 dGTP: deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。
3.2.7 dTTP: deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸。
3.2.8 dUTP: deoxyuridine triphosphate，脱氧尿苷三磷酸。
3.2.9 UNG： uracil N-glycosylase，尿嘧啶N-糖基化酶。
3.2.10 Ttis: tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。
3.2.11 Ct值:每个反映管内的荧光信号达成设定的阈值时所经历的循环数。
4　 原理
采用TaqMan方法，在比对脂环酸芽孢杆菌16S r RNA基因序列的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针。探针5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表达)，3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表达)，它在近距离内能吸取5’端荧光基团发出的荧光信号。PCR反映进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸取，仪器检测不到荧光信号；而反映进行到延伸阶段时，Taq酶的5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸取而被检测仪所接受。随着PCR反映的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现相应关系。
5　 试剂和材料
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为灭菌双蒸水。
5.1 K液体培养基(见附录A)。
5.2 引物
5’- CGTAGTTCGGATTGCAGGC -3’
5’- GTGTTGCCGACTCTCGTG -3’
5.3 探针
5’-FAM-CGGAATTGCTAGTAATCGC-TAMRA-3’
5.4 Taq DNA聚合酶。
5.5 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
5.6 DNA提取试剂：0.1%Chelex100水溶液。
5.7 10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（Ph8.4），200 mmol/L氯化钾，15 mmol/L氯化镁。
5.8 脂环酸芽孢杆菌质控菌株：ATCC 49025。
6 仪器和设备
6.1 荧光PCR仪。
6.2 离心机:20 000 rpm/min。
6.3 微量移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。
6.4 水浴锅。
7 检查程序
24 h-48 h
样 品
25 mL (g) + K液体培养基225 mL
取1 mL菌液进行细菌模板DNA提取
荧光PCR检测
结果报告

47℃

图1 荧光PCR检测脂环酸芽孢杆菌程序图

8 环节
8.1 取样和增菌
取样前消毒样品包装的启动处和取样工具。以无菌操作取样品25 mL (g)，加在225 mL的K液体培养基中，振摇使样品充足混合后，47℃恒温振荡培养24 h~48 h。
8.2 模板DNA准备
取增菌液1 mL加到1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，尽量吸弃上清液；加入50 μL DNA提取液（使用前室温解冻并充足混匀，快速吸取），混合后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液以待检测（如不能及时检查，可将上清液于-20℃保存）。
也可按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。
8.3 荧光PCR检查
反映体系总体积为25 μL，其中含：10×PCR缓冲液2.5 μL、引物（10 μmol/L）各1μL、探针（10 μmol/L）1μL、dNTP（10 mmol/L）1μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、水16 μL、模板DNA 2 μL。反映环节一：95℃预变性3 min。反映环节二：95℃变性30 s，55℃退火延伸30 s，同时收集FAM荧光，共进行40个循环。反映产物可在4℃保存。
检查过程中分别设阳性对照、阴性对照。脂环酸芽孢杆菌DNA作阳性对照，以灭菌水作为阴性对照。
9 结果与判断
检查样品Ct值小于或等于35.0时，报告脂环酸芽孢杆菌筛选阳性；样品Ct值大于35.0且小于40.0时，反复一次，假如Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告脂环酸芽孢杆菌筛选阳性，否则报告脂环酸芽孢杆菌未检出；样品检测不到Ct值时，报告脂环酸芽孢杆菌未检出。
10 废弃物解决和防止污染的措施
检查过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧解决。
检查过程中防止交叉污染的措施见附录B。

附 录 A
（规范性附录）
K液体培养基制作

A.1 成分
蛋白胨 5.0 g
酵母提取物 2.5 g
葡萄糖 1.0 g
吐温-80 1.0 mL
蒸馏水 1000.0 mL
A.2 制法
将各成分加入蒸馏水中溶解，用25%苹果酸调pH值至4.0±0.2。121℃高压灭菌15 min。

附 录 B
（资料性附录）
检查过程中防止交叉污染的措施

B.1 抽样和制样过程

抽样和制样工具，必须清洗干净，121℃高压灭菌15 min~20 min，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应当通过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。

B.2 检查过程

B.2.1 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区和后PCR区。将模板提取、PCR反映液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等环节分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单向进行。
B.2.2 实验过程中，必须穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。
B.2.3 各区所有的试剂、器材（特别是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。
B.2.4 所有溶液、水、耗材和器具要121℃、15 min高压，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液必须使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20℃~25℃贮存的试剂中，可加入0.025%叠氮化钠。所有试剂应当以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
B.2.5 DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产气愤溶胶。
B.2.6 前PCR区中，最佳能在PCR操作箱中加入PCR反映各组分。
B.2.7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。
B.2.8 可使用UNG酶和dUTP系统控制污染。
B.2.9 应遵循PCR操作的其他规定。