T∕CACM 1027.105-2018 白及快速PCR鉴定-(高清版).pdf
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1、ICS 11.100 C 23 团体标准 T/CACM 1027.1052018 白及快速 PCR 鉴定 Quickly PCR identification of Rhizoma Bletillae 2018-11-19 发布 2018-11-19 实施 中 华 中 医 药 学 会 发 布 T/CACM 1027.1052018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方案.2 5 仪器设备使用要求.2 5.1 总体要求.2 5.2 仪器设备要求.2 6 试剂和溶液配制.3 6.1 总体要求.3 6.2 试剂和溶液配制要求.3 7 检验程序.4
2、7.1 要求.4 7.1 程序.4 8 结果判定.6 9 结果报告.6 9.1 一般要求.6 9.2 鉴定报告.6 10 质量保证.7 11 废弃物处理.7 附录 A(资料性附录)白及快速 PCR 鉴定体系的建立.8 T/CACM 1027.1052018 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写给出的规则起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准由中华中医药学会提出并归口。本标准主要起草单位:贵阳中医学院,中国中医科学院中药资源中心,广东省药品检验所。本标准主要起草人:周涛,袁媛,黄璐琦,杨志业,赵丹,
3、蒋超,赵玉洋,周骏辉。T/CACM 1027.1052018 1 白及快速 PCR 鉴定 1 范围 本标准规定了白及快速PCR鉴定的方案、仪器设备使用要求、试剂和溶液配制、检验程序、结果判定、结果报告、质量保证和废弃物处理的要求。本标准适用于白及药材、饮片、种子和种苗鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 中华人民共和国药典(2015年版一部和四部)3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 白及
4、Bletillae Rhizoma 兰科植物白及的干燥块茎(参见附录 A)。3.2 检验样品 test sample 按一定规则取自某一整体,能反映该整体的相关信息,可以作为判断该整体情况的一个或多个部分。3.3 DNA提取 DNA extraction 从样品中提取出DNA的方法。3.4 DNA扩增 DNA amplification 通过一定技术使一段特定的 DNA 片段拷贝数增加的过程。注:可通过聚合酶链式反应技术实现DNA扩增。T/CACM 1027.1052018 2 3.5 聚合酶链式反应(PCR)polymerase chain reaction 一种用于扩增特定DNA片段的分子
5、生物学技术,即DNA片段的特异性体外扩增过程,其特异性依赖于与目的DNA片段两端互补的寡核苷酸引物。3.6 阳性对照 positive control 使用对照样品代替检验样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过程可获得目标核酸片段的操作。3.7 阴性对照 negative control 使用常见伪品药材代替检验样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于确认检测系统能够满足白及鉴别的操作。3.8 空白对照 blank control 以水代替检验样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸污染的操作。4 方案 白及快速PCR鉴定应采用抽
6、取有代表性的检验样品与对照样品比较的验证方式,即依据白及特异性DNA位点差异,使用SNP(单核苷酸多态性)标记法进行鉴定。利用碱裂解法提取白及DNA,以白及DNA为模板进行PCR扩增,采用荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。5 仪器设备使用要求 5.1 总体要求 所有制备样品使用的器具在使用前应进行灭菌处理。5.2 仪器设备要求 5.2.1 PCR 仪 使用前应进行温度校准。5.2.2 手持式紫外灯 能发出波长为365nm的紫外光。T/CACM 1027.1052018 3 5.2.3 连续可调微量移液枪 应包括0.1L2.5L、0.5L10.0L、10L100L、100L1000L规
7、格,并包括配套的一次性吸头。5.2.4 保温设备 应包含4与-20温区。5.2.5 离心设备 能离心200L PCR管与1.5mL离心管。5.2.6 电泳仪 电源应为具有稳压器的直流电源,电压100V500V。5.2.7 凝胶成像系统 系统应包含密封暗箱、摄像头、白光和紫外光(UV)254nm、302nm、365nm光源,UV保护挡板。5.2.8 电子天平 最大称量值至少应为1g,可读性精度至少应为1mg。5.2.9 pH计 测量范围至少应为014,精度至少应为0.01。5.2.10 研磨设备 至少能匀浆20mL的匀浆机,或至少能研磨20mg的粉碎仪器。5.2.11 核酸检测仪 波长范围应包含
8、200nm400nm,检测样品量至少应为0.1L,检测精度应不低于2ngL-1。6 试剂和溶液配制 6.1 总体要求 除另有规定外,实验试剂为不含DNA和DNA酶的分析纯或生化试剂;实验用水应符合GB/T 6682无菌双蒸水或超纯水的要求;所配制的试剂均应灭菌后保存,并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效日期和配制者姓名;PCR试剂应小量分装保存以减少污染;材料及试剂的保存都应有防污染措施。6.2 试剂和溶液配置要求 6.2.1 DNA 提取缓冲液 T/CACM 1027.1052018 4 含有0.5mol L-1氢氧化钠(NaOH)、1%聚乙烯吡咯烷酮40(PVP40)、1
9、%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X 100)溶液:在800mL超纯水中溶解20.0g NaOH,冷却至室温后加入10.0g PVP40和10mL Triton X 100,溶解后加超纯水定容至1000mL,过滤除菌分装使用。6.2.2 中和缓冲液 含有0.1molL-1三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)溶液pH8.0:在800mL超纯水中溶解12.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),冷却至室温后用浓盐酸调节至溶液的pH8.0,加超纯水定容至1000mL,分装后高压灭菌。6.2.3 Taq 酶(热稳定性 DNA 聚合酶)PCR 预混液 0.05 UL-1 Taq聚合酶,2PCR反应缓冲液
10、,4mM硫酸镁(MgSO4),0.4mM等量的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)混合物。检测用Taq酶应无35核酸外切酶活性。Taq酶PCR预混液在-20下保存,使用时置于冰上操作。6.2.4 白及检测用引物对序列 BJ59-412F:5-GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-3。BJ59-412R:5-TTGGCACGGAGCGACACG-3。用无菌双蒸水将上述引物溶解至10molL-1。6.2.5 50 TAE(三羟甲基氨基甲烷-冰醋酸-乙二胺四乙酸二钠)电泳缓冲液 在800mL无菌双蒸水中溶解242.0g Tris,37.2g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDT
11、A2H2O),加入57.1mL冰醋酸,充分混匀,加灭菌双蒸水定容至1000mL,使用时用无菌双蒸水稀释50倍。7 检验程序 7.1 要求 为防止交叉污染,收样、取样、粉碎、DNA提取、核酸扩增与产物检测应在不同操作间或在同一操作间不同隔离区域进行,进入各区域应严格按照单一方向进行,即样品制备区核酸制备区扩增区检测区。7.2 程序 7.2.1 取样 7.2.1.1 要求 检验样品应分为2批,每批可分为等量的3份,总量不低于100g。收样时应检查包装的完整性,并在样品袋上贴上标签,填写采集数据表。对商品包装和送样说明进行拍照记录,照片随样品一起备档。7.2.1.2 药材和饮片 检验样品抽样方法按照
12、中华人民共和国药典(2015年版四部)药材和饮片取样法(通则0211)进行取样。去除药材和饮片表面附着物,依次使用75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。T/CACM 1027.1052018 5 7.2.1.3 种子种苗 检验样品、试样的抽取、分取应有代表性。在生产基地取样,送验样品可为组织或器官;在加工或销售地点取样,检验样品为种子或种苗。7.2.2 粉碎 取检验样品置于乳钵、匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨粉碎,必要时加适量液氮研磨。7.2.3 DNA 提取 称取经预处理的检验样品20mg置于2.0mL离心管中;加入200L提取缓冲液,充分混匀,在沸腾的水浴中保存10s15s,取出;加入800
13、L中和缓冲液,充分混匀;12000rmin-1离心1min或静置5min;转移500L上清液至一新的1.5mL离心管,加入500L中和缓冲液,充分混匀;12000rmin-1离心1min或静置5min;转移上清液作为DNA模板待测或-20保存备用。每个检验样品应设置两份平行样,每一次从检验样品提取核酸的过程都应设置一个提取空白对照。注:使用碱裂解法提取的白及DNA可在4下保存3天或-20下保存7天,不宜长期保存。7.2.4 DNA 质量检测与调整 扩增时,先吸取1L DNA溶液,采用核酸定量检测仪测定DNA浓度和纯度,将浓度调整为60ngL-1。注:使用碱裂解法提取的DNA,不宜使用琼脂糖凝胶
14、电泳法检测DNA质量。7.2.5 PCR 扩增 7.2.5.1 方法要求 首次使用本方法时,应校对PCR仪温控准确性,并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的Taq酶PCR预混液的适用性。7.2.5.2 对照试验 送检样品进行PCR检测应设置2份平行样,并设置阳性对照、阴性对照和空白对照。7.2.5.3 PCR 反应体系 在200L的PCR管中进行,反应总体积为25L,反应体系Taq酶PCR预混液7L,鉴别引物各1L(10molL-1),DNA模板1L(60ngL-1),无菌双蒸水补足。将反应液充分混匀,瞬时离心。7.2.5.4 PCR 反应参数 按反应体系加样完成后,瞬时离心,置于PCR仪内,进
15、行PCR反应。设置反应程序为:95预变性45s;95变性2s,65退火延伸5s,30次循环。对扩增产物进行检测或置于4下保存。7.2.6 扩增产物检测 7.2.6.1 方法要求 选用荧光染料显色检测或琼脂糖凝胶电泳检测的任一种检测方法进行扩增产物检测。T/CACM 1027.1052018 6 7.2.6.2 荧光染料显色检测 PCR反应结束后,在PCR扩增产物内加入2L 100 SYBR Green I染料,混匀后于365nm紫外波长下检测荧光,若PCR产物出现与阳性对照相同的荧光即为阳性结果,反之为阴性结果。7.2.6.3 琼脂糖凝胶电泳检测 称取琼脂糖约0.2g,加入1TAE电泳缓冲液1
16、0mL,加热至完全溶解,趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm7.5cm或4cm9cm)的水平玻璃板,涂层厚度约3mm,垂直插入梳子,静置,待凝胶结成无泡均匀层,垂直拔出梳子。取PCR扩增产物6L,加入点样孔中。转移胶板至电泳仪中,加入1TAE缓冲液至没过胶面约3mm处,调节电压至85V、85mA电泳约30min。将凝胶转移至核酸凝胶染色剂(GelRed)等溶液中染色。将染色后的凝胶转移至紫外凝胶成像系统中观察。阴性对照和空白对照无条带,且检验样品与阳性对照在350bp450bp之间有一条DNA条带为阳性结果,否则为阴性结果。8 结果判定 在阴性对照、阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下,若检
17、验样品与阳性对照一致,则判定测试结果为阳性,否则为阴性。若荧光染料法显色为阴性结果,还应通过琼脂糖凝胶电泳检测方法进行确证。9 结果报告 9.1 一般要求 定性检测结果应表示为阳性“”或阴性“”。9.2 鉴定报告 样品经检测后,实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录,出具检测报告。检测报告至少包含以下内容:a)检验样品的名称、状态和明确的标识;b)检测依据;c)取样方法与日期;d)储存条件;e)检测开始和结束日期;f)检测负责人和实验人员;g)阳性对照、阴性对照、检验样品;h)检测结论;i)检测过程观察到的特别情况;j)其它需要报告的内容。T/CACM 1027.1052018
18、 7 10 质量保证 检测结果应来自同一实验室样品的两份检验样品。当一份检验样品的结果为阳性,另一份为阴性时,应重新测试。可以适当调整核酸扩增反应体系中各成分的用量,使两份样品得到相同结果。每个样品应至少检测2份平行样,核酸定量检测仪检测模板DNA的纯度和浓度,DNA浓度应高于10ngL-1。也可采用常规的改良十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)或白及鉴定试剂盒对比提取检验样品DNA的质量,保证DNA的提取效率,避免出现假阴性结果。核酸扩增可设置PCR抑制剂对照。如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测,检测结果不一致,可在检测报告中注明检测低限,检测低限应符合最低含量水平。11 废弃物处理
19、检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理,有毒有害废弃物应经过除害再进行处理,处理应符合环保要求。T/CACM 1027.1052018 8 附 录 A (资料性附录)白及快速 PCR 鉴定体系的建立 A.1 白及与其伪品资料 中药白及具有收敛止血、消肿生肌的功效,可用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂的治疗。历版中华人民共和国药典(2015 年版一部)规定白及的原植物均为兰科白及属植物白及Bletilla striata Rchb.f.。由于白及分布具有地域性,一些地方中药材标准贵州省中药材、民族药材质量标准(2003 年版),四川省中药材标准(2010 年版)、甘肃省中药材标准(
20、2009 年版)以黄花白及B.ochracea Schltr.植物作为白及药材的药用来源。通过实地走访和调查发现,由于白及和同属植物黄花白及、小白及的植物形态相似,只有在开花期才能准确鉴定,市场上以黄花白及、小白及B.formosana(Hayata)Schltr.、华白及B.sinensis(Rolfe)Schltr.冒充白及出售的现象极为普遍,而且以同科植物独蒜兰Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe、苞舌兰Spathoglottis pubescens Lindl.、长距美冠兰Eulophia faberi Rolfe、竹叶兰Arundina grami
21、nifolia(D.Don)Hochr.,及市场上称为水白及多为二叶独蒜兰Pleione scopulorum W.W.Smith、紫花美冠兰Eulophia spectabilis(Dennst.)Suresh、毛梗兰Eriodes barbata(Lindl.)Rolfe 植物的块茎作为白及药材使用的现象也屡见不鲜,白及疗效得不到保证。因此,准确鉴定白及,对白及药材的质量稳定、可控及临床用药安全、有效具有现实意义。目前,针对白及的鉴别已有一些研究报道,但多以与白及亲缘关系相对较远的百合科植物黄精、玉竹、射干、知母等植物为对象进行对比鉴别;也有研究显示白及与水白及的表皮细胞特征上有明显区别,
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