(高清版)DB36-T 1415-2021猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程.pdf
《(高清版)DB36-T 1415-2021猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《(高清版)DB36-T 1415-2021猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程.pdf(21页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、ICS 67.080.01 B 05 DB36 江西省地方标准 DB36/T 14152021 猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程 Identification of male and female germplasm of Actinidia by molecular identity card 2021-06-30 发布 2022-01-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 14152021 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 试剂与试药.1 6 仪器设备.1 7 操作步骤.2 8 结果记录与判定.3 附录
2、 A(资料性)主要试剂与试药.5 附录 B(资料性)主要仪器设备.7 附录 C(规范性)猕猴桃雌性种质特异性引物.8 附录 D(规范性)猕猴桃雄性种质特异性引物.11 附录 E(资料性)67 份猕猴桃雌性种质分子身份证.14 附录 F(资料性)33 份猕猴桃雄性种质分子身份证.16 DB36/T 14152021 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件主要起草单位:江西农业大学。本文件主要起草人:廖光
3、联、徐小彪、黄春辉、钟敏、贾东峰、曲雪艳、吴茵、涂贵庆、朱壹、魏清江、辜青青、陈明。DB36/T 14152021 1 猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了分子身份证鉴定猕猴桃(Actinidia)雌雄种质的术语和定义、原理、试剂与试药、仪器设备、检测及构建分子身份证方法。本文件适用于猕猴桃雌雄种质鉴定与分子身份证构建。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T 3639 中华猕猴桃品种鉴定 SSR分子
4、标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 分子身份证 identity card 以特异性引物为探针,同猕猴桃细胞核DNA的酶切片段杂交,可以获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带,人为将同一位置条带在不同物种上的有无标记为1/0,构建成数字矩阵,同一物种间极少有两个品种(系)完全相同,故称为特异性分子身份证。3.2 相似度 similarity 供试品种分子身份证与对照分子身份证相似的程度。4 原理 利用CTAB法提取植株叶片DNA,与特异性引物混合后进行PCR仪扩增,并在丙烯酰胺凝胶进行分离和显现,采用人工读取条带的方式绘制1/0矩阵,构建成DNA分子身份证,最
5、后统计供试品种和对照品种的相似度,根据相似度鉴别猕猴桃种质的真伪。5 试剂与试药 主要试剂与试药见附录A。DB36/T 14152021 2 6 仪器设备 主要仪器设备见附录B。7 操作步骤 7.1 样品制备 参照NY/T 3639执行。7.2 DNA 的提取 7.2.1 准备工作 水浴锅水浴加热至65,预热3%裂解液、洗液,两种液体使用前均需加入2%体积的-巯基乙醇(V/V);-20预冷无水乙醇和75%乙醇(现配后预冷)。7.2.2 称样 称取0.10 g新鲜/硅胶干燥后的叶片样品于2 mL管子,磨样机磨成粉状。7.2.3 第一次洗涤 硅胶干燥后的叶片样品需要进行的步骤。向2mL管子中加入1
6、 mL洗液,充分混匀,65水浴30 min,中间轻摇数次,使其充分混匀;随后10000 rpm/min 离心5 min。7.2.4 第二次洗涤 硅胶干燥后的叶片样品需要进行的步骤。弃上清液,向2 mL管子中加入1 mL洗液,充分混匀,65水浴30 min,中间轻摇数次,使其充分混匀;随后10000 rpm/min 离心5 min。7.2.5 裂解 弃上清液,向2 mL管子中加入1 mL CTAB裂解液,充分混匀,65水浴1 h以上,中间轻摇数次,使其充分混匀;冷却至室温,随后12000 rpm/min 离心10 min。7.2.6 第一次抽提 取上清液(可0.80 mL)于新的2 mL管子中,
7、加入等体积抽提液1,摇床混匀10 min,随后12000 rpm/min离心10 min。7.2.7 第二次抽提 取上清液(可0.60 mL)于新的2 mL管子中,加入等体积抽提液2,摇床混匀10 min,随后12000 rpm/min离心10 min。7.2.8 沉淀 取上清液(可0.50 mL)于新的1.50 mL管子中,加入1/10体积NaAC,2.50倍体积的预冷的无水乙醇,-20沉淀30 min以上,随后4,10000 r rpm/min离心8 min。此步骤肉眼可见沉淀。7.2.9 漂洗 DB36/T 14152021 3 弃上清液,加入1 mL 75%无水乙醇,沉淀30 min。
8、每隔30 min漂洗一次,共漂洗4次。7.2.10 干燥 打开盖子放入旋蒸仪,设定DAL模式,30,8 min,干燥至无液体即可(避免乙醇影响后续PCR),不可过度干燥。7.2.11 溶解 往每个管子中加入60 L RNA溶解酶(按RNase:TE缓冲液=3 l:1000 l配制)。4放置过夜后用超微分光光度计测定DNA质量。OD260/OD280的值在1.802.00时,表明DNA的纯度较好。测定后用TE缓冲液将DNA含量稀释至150 ng/l。7.3 PCR 扩增 7.3.1 特异性引物 选用猕猴桃雌雄种质特异性引物(附录C、附录D)进行PCR扩增。7.3.2 扩增反应体系 包含2Taq
9、PCR Mix 5 L;上下游引物各0.80 l;模板DNA 1 l;双蒸水2.40 l。7.3.3 扩增程序 94预变性3 min,94变性30 s,5262退火30 s,72延伸30 s,共28个34个循环,最后72延伸10 min于12保存。7.4 丙烯酰胺凝胶电泳 7.4.1 制胶 按顺序往150 mL烧杯加入双蒸水60 mL、5X TBE 20 mL、40%聚丙烯酰胺20 mL、APS 864 L、TEMED 76 L,搅拌均匀后灌入DNA序列分析电泳仪玻璃板中,排气泡后插入梳齿,凝固1 h后进行下一步。7.4.2 点样 拔出梳齿,用移液枪移取1 L PCR扩增产物,点入梳齿孔中;同
10、时点入500 bp DNA marker及10 X Loading Buffer。7.4.3 跑胶 使用仪器为DYCZ-20G型DNA序列分析电泳仪,先50 V电压跑30 min,随后调为200 V,待10 X Loading Buffer 跑到接近玻璃板底部时结束。7.4.4 染色 采用快速银染法,将丙烯酰胺凝胶取下放入硝酸银溶液,浸染10 min。7.4.5 显影 从银染液中取出凝胶,用双蒸水冲洗干净后,放入显影液中显影,待条带全部显出,转入到清水中。DB36/T 14152021 4 8 结果记录与判定 8.1 结果记录 拍照记录并统计清晰的SSR条带,采用人工读带的方法,在Micros
11、oft Excel中以二进制读带方式记录引物扩增的结果,同一位点上具有相同迁移率的条带记为1,无带记为0,记录位点位置(见附录E、附录F)。8.2 构建分子身份证 利用同一样品的不同引物条带读数绘制成1/0矩阵,构建成该品种的特异性分子身份证,如附录E、附录F所示。8.3 判定 根据相似度进行结果判定,相似度=(同一位点读数相同的数量/总位点数)*100%,相似度等于或大于99%,即可判定为在分子水平上是同一个样品。DB36/T 14152021 5 A A 附 录 A(资料性)主要试剂与试药 A.1 试剂-巯基乙醇,Tris,HCl,EDTA,NaOH,NaCl,PVP,CTAB,NaAC,
12、无水乙醇,RNA裂解酶,琼脂糖,DNA核染液,Loading Buffer,硝酸银,甲醛,Na2CO3,2Taq PCR Mix,硼酸,过硫酸铵,丙烯酰胺,甲叉丙烯酰胺,TEMED。A.2 配制试剂(灭菌后使用)A.2.1 1 M Tris-HCl 称取12.11 g Tris,溶于水后定容至100 mL,用HCl调节pH为8。A.2.2 0.50 M EDTA 称取18.61 g EDTA,溶于水后定容至100 mL,用NaOH调节pH为8。A.2.3 洗液 1.46 g NaCl,25 mL 1 M Tris-HCl,10 mL 0.50 M EDTA,2 g PVP,溶于水后定容至100
13、 mL。A.2.4 3%裂解液 称取3 g CTAB,8.19 g NaCl,10 mL 1 M Tris-HCl,4 mL 0.50 M EDTA,0.50 g PVP,溶于水后定容至100 mL。A.2.5 TE缓冲液 1 mL 1 M Tris-HCl,0.20 mL 0.50 M EDTA,溶于水后定容至100 mL。A.2.6 3 mol/L NaAC 称取40.82 g NaAC,溶于水后定容至100 mL。A.2.7 5X TBE Tris 54 g,硼酸27.50 g,20 mL EDTA,定容至1000 mL。A.2.8 10%过硫酸铵 过硫酸铵1 g溶于10 mL 双蒸水,
14、4保存。A.2.9 40%聚丙烯酰胺 丙烯酰胺190 g,甲叉丙烯酰胺10 g,溶解后定容至500 mL。A.2.10 银染液 DB36/T 14152021 6 1 g硝酸银溶于1000 mL超纯水,定容至1000 mL即可,使用前加入2 mL甲醛。A.2.11 显影液 20 g NaOH,0.40 g Na2CO3,溶于1000 mL超纯水,定容至1000 mL即可。A.2.12 抽提液1 苯酚、氯仿、异戊醇按体积比为苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1配制。A.2.13 抽提液2 氯仿、异戊醇按体积比为氯仿:异戊醇=24:1配制。DB36/T 14152021 7 B B 附 录 B(资料
15、性)主要仪器设备 B.1 电子分析天平 精确度万分之一。B.2 恒温水浴锅 最高温度100。B.3 离心机 最大离心速度12000 rpm/min。B.4 超微量紫外分光光度计 最大离心速度12000 rpm/min。B.5 PCR仪 常规。B.6 DNA序列分析电泳仪 220 V电压。B.7 摇床 最大转速200 rpm/min。B.8 旋蒸仪 常规。DB36/T 14152021 8 C C 附 录 C(规范性)猕猴桃雌性种质特异性引物 C.1 雌性种质特异性引物 雌性种质特异性引物见表C.1。表C.1 雌性种质特异性引物 引物 序列 退火温度 等位基因长度(bp)TGGCGACATGGT
16、CTTCTTAG 27 TCCAAAGCATGCTCAACTTC 54 100150 CCAAGCTCATACACCCAATG 31 AGGTTGGCACTTGGAATAGG 57 200250 TTCCTTAATCCAGGGTCTCG 53 ACACAACAGATTGCAGGAGG 63 150200 GAGTCGGGAGCATAATTGGT 50 CGCATGGAAGGTCATAACAC 54 250300 GTGCTCCTCCGTCCATGTAT UDK97-408 CGTCCTCTCTTCGCCATTTA 64 100150 TGGTGTAAAGTCAAAAACAGCC UDK99-1
17、43 AGAAGATTTCATTGTCCTCCCT 59 100200 AAGAGCCATAGCTTATTCACCG UDK96-035 AAGTAAAGCCATTGTCATTGCA 60 100150 AACTAAGAAACGGGACCATTG 1 TATGTGGATGTCCCAGAAAAG 62 150200 CCCCTCATTGTAAAGCATCC 11 TTGTCACGGGCTTAGAATCC 62 150200 CCGTCTCAGCAGATGTCACTAT 15 GCAACTGCCCATAAGATTCC 52 150200 TACACCTGATGAGATGGACGAC 22 CCTG
18、TGGCTGATGTTGAAAGT 54 200250 TCGAGTTACCTAGCTACTCCGC UDK96-040 CAAGGGAAGAAAATGTTGAACC 62 150200 GTAAGGTCATTTTTGCGAAAGG UDK96-053 TTTGTTGGGAGTAACGTGAGG 64 50100 TACGCAGTTTACTTCCTCTT A017 CATTCGGCACCACTTCTA 60.50 150200 A043 CCCATAGCCAACAACATC 59 150200 DB36/T 14152021 9 表 C.1 雌性种质特异性引物(续)引物 序列 退火温度 等位基
19、因长度(bp)CTTGACGCCTCTGAACAC TCCATTCCGCCCATCCTT A055 GTCCGACATTCTTGTGGTTCTG 60.50 100250 ATCTCCATCATCTCCACCTT A061 CAACGCCATCATTGTCCC 60 100150 GAAGCAACTCGCTACTAAG A069 AGCCTGTAACAACCCATT 60.50 100200 TTGCTCCAGTTTCCTTCT A080 TGCTATGGCACTCTATCC 60 150250 GAGCATACAGAGGGAAGA A103 ACTGGAGTGAAGGAGGGT 59 200
20、300 CCTCATTCATTACCACCTCTT A105 ACACCGCTTCCGTCCATA 60.50 100200 CACCTGCTACACCGACAT A123 CCACAGCCGAAACCATAC 60.50 150300 ATACCGTGGACTTCATTC A124 ACATACCTTCAACGCTTC 60 150250 GTTTATTACACGCCTTCG A125 TGACAGCCCTCAACTACG 59 150200 CCCTATACCCACTCAATCA A138 TTCCACCTTCTTTCCATC 60 100250 ATGGCTTGACTGAGACTTG A
21、167 TTCATCGTCGGTTGTAGC 58 150250 CTCCCTCGTAGCAGTTCA A186 CTCCAGCGATTCCTTCAC 60 100200 CCGCATCATAAGCCCAATC A191 TTGTCCACCGCCCACTTC 60 150300 ATACCCATCATCGGACAC A193 CTTCAAGCCCATTACCAC 61 150250 CGACTAAAATCTACAAGCAC EST-Ad01 GAAAACGAAATTAACACCA 62 200300 TTAAGATTGATCGGCACG EST-Ad03 CCTTCTGGATGAGGGTTT
22、61 250500 GTTAATTTGATCGGGATGG EST-Ad42 GAGGAGCTTGAGCTGCTAT 62 250400 ATACACTTGAAGCGCCGC UDK96-019 AAGCAGCCATGTCGATACG 57 100200 UDK96-028 TCCCCACACAACAACTCCTC 52 100200 DB36/T 14152021 10 表 C.1 雌性种质特异性引物(续)引物 序列 退火温度 等位基因长度(bp)CATATGACCTGCACGTGC GGTTTGATCGGTCTTCGAAA UDK96-039 ATAAATGTGTGCCAGTGCGA 57
23、 150200 GAGCGTAGAATGTGGCGG UDK97-420 CATTTGAAATGAGTCAAGCTGC 60.50 100150 AACGAAACAAAAGCCCTATTATC ST-Acd02 GCTTCAGATTCAGCCTCTGG 59 200300 TTCATCCCAATCCCTCATTC ST-Acd07 GACTTCTTCGTCGCCTCTG 58 200250 GATGGCTGACGAACAACA ST-Ad037 TCTGTCACGATCACCTCC 58 100200 CCACTCTTCGCCTCTCTTTCA UTH 03-04 AGTGGTTGTGTTGG
24、GGTCTC 57 150200 DB36/T 14152021 11 D D 附 录 D(规范性)猕猴桃雄性种质特异性引物 D.1 雄性种质特异性引物 雄性种质特异性引物见表D.1。表D.1 雄性种质特异性引物 引物 序列 退火温度 等位基因长度(bp)TGGCGACATGGTCTTCTTAG 27 TCCAAAGCATGCTCAACTTC 54 100150 TTCCTTAATCCAGGGTCTCG 53 ACACAACAGATTGCAGGAGG 63 150200 GTGCTCCTCCGTCCATGTAT UDK97-408 CGTCCTCTCTTCGCCATTTA 64 100150
25、TGGTGTAAAGTCAAAAACAGCC UDK 99-143 AGAAGATTTCATTGTCCTCCCT 59 100200 AAGAGCCATAGCTTATTCACCG UDK 96-035 AAGTAAAGCCATTGTCATTGCA 60 100150 AACTAAGAAACGGGACCATTG 1 TATGTGGATGTCCCAGAAAAG 62 150200 GTTGTTGAGGTGATTGTTGATG 5 CAGTCAGCCAAGGACFAAGG 61 150200 ACTAACAGACAAAAACTGGGGG 13 ATGGAAGGAGATGGCGATG 58 20025
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 高清版DB36-T 1415-2021猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程 高清版 DB36 1415 2021 猕猴桃 雌雄 种质 分子 身份证 鉴定 技术规程
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【Fis****915】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【Fis****915】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。