(高清版)DB36_T 1366-2021柑橘黄龙病检测鉴定技术规程.pdf
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1、 ICS 65.020.01 B 05 DB36 江西省地方标准 DB36/T 13662020 柑橘黄龙病检测鉴定技术规程 Technical regulation for detection of Candidatus liberibacter asiaticus using the PCR 2020-12-29 发布 2021-07-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 13662020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件
2、起草单位:国家脐橙工程技术研究中心。本文件主要起草人:易龙、黄爱军、苏华楠、赖晓桦、卢占军、钟八莲。DB36/T 13662020 1 柑橘黄龙病检测鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了实验室检测鉴定柑橘黄龙病的PCR技术要求,针对CaLas的PCR检测方法。本文件适用于柑橘类植物感染柑橘黄龙病植株的PCR检测和鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 28062 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 GB/T 2939
3、3 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 3 术语和定义 GB/T 28062界定的术语和定义以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 柑橘黄龙病 Citrus Huanglongbing,HLB 由革兰氏阴性细菌引起的一种系统性侵染病害,在田间主要通过柑橘木虱、病穗嫁接传播,植株感病后典型症状为叶片斑驳状黄化,果实着色与正常果实相反,又称“红鼻果”,果小质劣,是一种重要的检疫性病害。3.2 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction,PCR 一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。4 柑橘黄龙病菌基本信息 柑橘黄龙病菌是一种革兰氏阴性细菌,其暂定分类地位为:变形菌门(
4、Proteobacteria),-变形菌纲(Alphaproteobacterial),根瘤菌目(Rhizobiales),根瘤菌科(Rhizobiaceae),韧皮部杆菌属(Liberibacter)。该属三种细菌是柑橘黄龙病的病原菌,分别为韧皮部杆菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CaLas),韧皮部杆菌非洲种Candidatus Liberibacter africanus和韧皮部杆菌美洲种Candidatus Liberibacter americanus,目前这三个种均不能人工纯培养,我国发病区及江西省内发病区的病原菌主要为其中的CaLas。
5、DB36/T 13662020 2 5 方法原理 柑橘黄龙病的病原菌属难培养菌,目前尚无方法进行人工培养,因此无法通过传统微生物培养的方法来鉴定病害。根据CaLas的16S 核糖体(16S rDNA)基因序列设计一对特异性引物,以疑似植株样品的总核酸为模板,进行PCR扩增,最终通过电泳技术检测有无特异性DNA条带,来判断检测样品是否感染CaLas。6 田间症状识别 柑橘黄龙病的田间症状具有一定复杂性,可出现叶片斑驳状黄化,缺素状黄化,均匀黄化,果实着色异常,树势减弱等。较为可靠的田间诊断症状为:叶片上出现的斑驳状黄化和挂果期出现的“红鼻果”症状,见附录A。叶片斑驳状黄化和“红鼻果”症状可以作为
6、黄龙病田间诊断的判断标准,要最终确诊,需要对疑似样品进行PCR检测。7 检测方法 7.1 样品的采集与保存 7.1.1 叶片样品 7.1.1.1 疑似症状植株取样,优先挑取有症状叶片。无症状植株,即按照树冠东、南、西、北四个方向采集,每个方向取树冠中下部成熟叶片五片,共采集叶片 20 张。7.1.1.2 苗圃取样时优先挑取表现疑似症状植株。没有发现疑似症状时,可按照抽检方规定抽检率随机抽取一定数目植株,每株取中下部成熟叶片 10 片。7.1.2 果实样品 幼果期采样时,每个植株按照东、南、西、北四个方向采集幼果,切取果柄、果蒂。商品鲜果取样时每批次果实随机抽取10个果实,取果实中柱。7.1.3
7、 样品的保存 采集的样品用样品袋进行分装,并做好每个样品的记录,样品记录和样品必须同时送实验室。实验室对于接收样品进行登记编号,存放于4条件下,及时进行样品DNA核酸抽提。7.2 主要的设备仪器和试剂 7.2.1 设备仪器 普通PCR仪,实验中需要用到的其他仪器设备参照GB/T 28062和GB/T 29393。7.2.2 主要试剂 除非另有说明,本标准所用试剂均为分析纯。十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)十二烷基硫酸钠(SDS)四甲基乙二胺二钠盐(EDTA-Na2)三羟甲基氨基甲烷(Tris Base)DB36/T 13662020 3 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)Triton X-100 蛋白酶
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